闕揚(yáng)銘，朱華麗，周雪峰，李兵兵，吳佳燕，劉海燕

0 引言

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為常見慢性肝臟病，發(fā)病率在20%～30%，主要表現(xiàn)為彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變[1]。NAFLD的發(fā)生會造成肝內(nèi)巨噬細(xì)胞和星狀細(xì)胞活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)與纖維化，嚴(yán)重者會進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌。硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是一種具有毒性作用的有害氣體，可造成神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)損傷等，在炎癥、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)興奮調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮的作用已被證實(shí)[2]。肝臟是H2S的重要代謝器官，因此，H2S對肝臟也具有調(diào)節(jié)作用，如對缺血再灌注等造成的肝臟損傷具有保護(hù)作用等[3]。

哺乳動物中H2S形成有多種途徑，其中3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3-mercaptopyruvate sulfur transferase，MPST)以3-巰基丙酮酸為底物催化產(chǎn)生H2S，并分布在肝臟、腎臟等部位[4]。但MPST是否參與肝臟脂質(zhì)代謝及在NAFLD發(fā)病中的具體作用機(jī)制仍不明確，國內(nèi)外已有報(bào)道[5-6]，現(xiàn)胱硫醚γ裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE)/H2S途徑參與脂肪肝形成，而MPST是否以同樣的依賴途徑調(diào)控脂肪肝過程則需進(jìn)一步確定。因此，本研究以C57BL/6小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討MPST對脂肪變性的影響及在NAFLD發(fā)病中的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠30只，雄性，6周齡，體重18～22 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司；高脂飼料購自美國Research Diets公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)購自杭州吉諾生物；PA溶液、ACS液購自南京森貝伽生物；DEOC水(上海生工生物)；二甲苯、乙醇、異丙醇、氯仿等購自上海國藥集團(tuán)；游離脂肪酸(Free fatty acid，F(xiàn)FA)檢測試劑盒購自美國Biovision；H2S檢測試劑盒購自泉州市睿信生物；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)購自英國Abcam公司。DNA提取試劑盒(杭州新景生物)；三酰甘油(Triglyceride，TG)和總膽固醇(Total cholesterol，TC)檢測試劑盒(北京普利萊生物)；熒光定量PCR試劑盒和Premix TaqTM(大連Takara生物工程)；RNA抽提Trizol、小鼠MPST重組腺病毒載體shRNA(AD-shRNA)和陰性對照組重組腺病毒載體(AD-GFP)由美國Invitrogen提供；MPST(美國Novus公司)；引物設(shè)計(jì)來自Primerbank數(shù)據(jù)庫(上海生工生物合成)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(ABI 7500，美國Bio-rad)；離心機(jī)購自德國Eppendor；恒溫烘箱購自太倉華利達(dá)；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；組織研磨儀購自武漢谷歌生物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 注射重組腺病毒 將10只C57BL/6小鼠以正常飲食飼養(yǎng)2周，暴露尾靜脈并用酒精棉球消毒，尾靜脈穿刺并快速推注AD-shRNA(8 s內(nèi))到小鼠體內(nèi)，觀察2 h后予以高脂飲食喂養(yǎng)，作為觀察組。同樣方法對另外10只小鼠尾靜脈高壓注射AD-GFP，2 h后予高脂飲食喂養(yǎng)，作為對照組。之后每2周注射1次，共8周(4次)，此期間均予高脂飲食。剩余10只小鼠以正常飲食喂養(yǎng)10周用來參照NAFLD動物模型的成功建立。處死前1 d禁食過夜，行眼球摘除采血后處死小鼠，取出肝臟，其中取1塊肝葉組織，福爾馬林固定后HE染色，其余肝組織用PBS沖洗，切割成多塊分裝置于液氮中冷凍，后于-80 ℃下長期保存。所有動物實(shí)驗(yàn)遵照動物倫理委員會規(guī)章執(zhí)行。

1.3.2 肝組織MPST表達(dá) 割取一小塊凍于液氮中的肝組織，置于研缽中研磨至粉末狀，加入1 ml的trizol后移至離心管中，加氯仿200 μl，渦旋混勻15 s。離心(12 000 g，4 ℃)后吸取上層液。加5 ml異丙醇并混勻，離心(12 000 g，4 ℃)，棄去上清液，加75%乙醇1 ml，洗滌沉淀，離心(12 000 g，4 ℃)。室溫沉淀10 min，干燥后加DEPC水溶解沉淀。測量RNA濃度，用DEPC水稀釋至100 ng/μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×PrimeScript Master Mix 2 μl，Total RNA模板2 μl，DEPC水3 μl?；靹蚝箅x心1 min(5 000 r/min，4 ℃)，37 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 s，獲取cDNA溶液，稀釋后保存于-20 ℃進(jìn)行熒光定量PCR。MPST mRNA擴(kuò)增片段的上游引物：5′-CACGCACTTTGCCGACTAC-3′，下游引物：5′-GCTGATTGGCAGGTTCTGATTC-3′。內(nèi)參GAPDH：上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)液：2×SYBR Premix Dimer Eraser 5 μl，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μl，ROX Reference Dye(50×)0.2 μl，cDNA模板1 μl，DEPC水3.4 μl?；靹蚝箅x心1 min(5 000 r/min，4 ℃)，封板，離心(2 000 r/min，4 ℃)2 min，上機(jī)。預(yù)變性：95 ℃ 30 s(×1)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s(×40)；溶解曲線：95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以目的基因與GAPDH光密度比值代表目的基因 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果以2-△△CT表示。

1.3.3 肝臟內(nèi)FFA含量檢測 肝臟FFA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品溶液水浴融化(80～100 ℃，1 min)，旋轉(zhuǎn)30 s。按每10 mg組織用200 μl氯仿-TritonX-100提取的比例配置足量體積的裂解液。肝組織樣品放至2 ml離心管中(預(yù)放磁珠)，置于冰上，加400～500 μl氯仿-TritonX-100，破碎、裂解，冰上靜置15 min。13 000 r/min離心10 min，將下層吸取至1.5 ml離心管中，為FFA提取液。風(fēng)干約40～60 min，真空干燥30 min，去除氯仿。加入200 μl的Fatty Acid Assay Buffer，渦旋振蕩5 min。加樣：在標(biāo)準(zhǔn)品孔中(96孔板)分別加0、2、4、6、8、10 μl的PA溶液，再加入Assay Buffer補(bǔ)至各孔體積為50 μl；在樣品孔中(96孔板)加50 μl溶解的脂質(zhì)液。各孔中加2 μl的ACS液，混勻后37 ℃下恒溫箱內(nèi)反應(yīng)30 min。配置50 μl反應(yīng)混合液加入孔內(nèi)，混勻后于37 ℃下恒溫箱內(nèi)反應(yīng)30 min。根據(jù)酶標(biāo)儀讀取的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算FFA濃度。用樣本中蛋白濃度(40倍稀釋測定)調(diào)整FFA含量，最終用nmol/g表示肝臟FFA含量。

1.3.4 肝臟內(nèi)TG和TC水平檢測 采用GPO Trinder酶法測定：取一小塊肝組織于離心管中，加500 μl裂解液，研磨、混勻。70 ℃水浴反應(yīng)10 min，離心(室溫，2 000 r/min，5 min)，取上清液至離心管中。取10 μl與190 μl工作液混合，室溫反應(yīng)10 min。開啟酶標(biāo)儀，將96孔板放于酶標(biāo)儀中，讀取OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算TG濃度，采用樣本中蛋白濃度調(diào)整TG、TC的含量(單位：μg/mg)。

1.3.5 HE染色 將福爾馬林固定的肝組織脫水、石蠟包埋，-20 ℃下過夜、切片，53 ℃下用多聚賴氨酸包被的載玻片烤片。60 ℃烤箱中烘烤90 min，脫蠟處理。浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各10 min，浸入100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各5 min，90%、80%和70%的乙醇中各5 min，ddH2O沖洗5 min，浸入蘇木素中5 min，流水沖洗10 s，PBS返藍(lán)30 s后流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，ddH2O沖洗，伊紅染色3 min、ddH2O沖洗。浸入70%、80%、90%乙醇中各1 min，無水乙醇5 min，二甲苯10 min。脫水后用中性樹膠封片，高倍鏡下觀察。

1.3.6 脂質(zhì)合成代謝關(guān)鍵蛋白檢測 將觀察組與對照組小鼠的肝組織按“2.2”項(xiàng)下方法操作，SREBP-1擴(kuò)增片段的上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATGTT-3′，下游引物：5′-TAAGGGGTTGGGAGTAGAGG-3′。FAS擴(kuò)增片段的上游引物：5′-CGGGGAGGATCAGCAGCCAAAG-3′，下游引物：5′-CAAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG-3′。CSE擴(kuò)增片段的上游引物：5′-AGAATTCTCTCGG GGGAGTT-3′，下游引物：5′-ACTACGTTTGGCGA GCTCAT-3′。結(jié)果用2-△△CT表示。

1.3.7 肝臟組織H2S含量 將小塊肝組織用ddH2O洗滌，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔、空白孔，分別加標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和PBS各50 μl。均加Balance Solution 5 μl，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加Conjugate 100 μl，蓋上封板膜混勻。37 ℃恒溫箱中孵育60 min。洗滌后加Substrate A液和B液50 μl，混勻。37 ℃恒溫箱中孵育15 min，加終止液50 μl。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀設(shè)置450 nm波長，讀取OD值。繪制H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中H2S含量，以單位重量肝組織蛋白濃度校準(zhǔn)，調(diào)整為H2S量(ng/g)表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抑制肝臟MPST表達(dá)對小鼠肝臟脂肪變性的影響

2.1.1 肝組織MPST的mRNA表達(dá)和FFA、TG、TC含量 觀察組小鼠肝臟MPST的mRNA表達(dá)水平與對照組相比顯著下調(diào)，F(xiàn)FA、TG、TC含量與對照組相比也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠肝組織MPST的mRNA表達(dá)和FFA、TG、TC含量比較

2.1.2 HE染色結(jié)果 對照組小鼠肝臟組織內(nèi)呈彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，且出現(xiàn)肝細(xì)胞炎性表現(xiàn)(見圖1)；觀察組小鼠注射了對MPST有抑制作用的AD-shRNA后，肝細(xì)胞脂肪變性的彌漫性減輕，炎性肝細(xì)胞減少(見圖2)。

圖1 注射AD-GFP小鼠的肝臟HE染色結(jié)果(400×)

2.2 MPST參與NAFLD發(fā)病的分子機(jī)制 觀察組小鼠肝臟SREBP-1、FAS的mRNA表達(dá)水平與對照組相比顯著下調(diào)，CSE的mRNA表達(dá)水平及肝組織H2S含量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖2 注射AD-shRNA小鼠的肝臟HE染色結(jié)果(400×)

表2 兩組小鼠肝組織SREBP-1、FAS、CSE表達(dá)和H2S含量比較

3 討論

脂質(zhì)代謝紊亂造成的肝內(nèi)脂質(zhì)沉積是NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)，目前研究認(rèn)為，肝臟中FFA含量的升高造成脂質(zhì)代謝紊亂，使肝臟氧化能力與代謝清除能力超出負(fù)荷，從而造成肝臟脂毒性損傷[7]。

本研究中，小鼠均采取高脂飲食喂養(yǎng)，以增加肝臟中FFA含量，形成NAFLD模型。為了驗(yàn)證模型的成功建立與否，本次有10只小鼠以正常飲食喂養(yǎng)10周，處死后，正常飲食小鼠肝臟形態(tài)正常，質(zhì)地中等，被膜光滑，切面光潔。而觀察組與對照組小鼠處死后的肝臟體積明顯增大，質(zhì)地較脆，切面油膩，確認(rèn)制模成功[8]。本研究結(jié)果顯示，觀察組小鼠肝組織MPST的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組，與觀察組注射的AD-shRNA抑制了肝臟MPST表達(dá)有關(guān)。觀察組小鼠的肝組織FFA、TG、TC含量低于對照組。肝臟FFA可來自食物攝取、肝臟合成、外周脂肪組織分解[9-10]，而兩組小鼠的喂養(yǎng)方式完全相同，因此FFA的差異只可能與肝臟中FFA合成量的不同有關(guān)，MPST表達(dá)的差異則是造成肝臟FFA含量不同的主要原因。觀察組小鼠肝組織的TG和TC水平顯著低于對照組，提示AD-shRNA對肝組織MPST表達(dá)的抑制作用減少了肝組織的脂質(zhì)沉積，提示肝組織MPST表達(dá)程度與脂質(zhì)沉積之間呈正相關(guān)[11]。

為分析MPST參與NAFLD的分子機(jī)制，本研究對比了兩組小鼠肝組織H2S含量及SREBP-1、FAS、CSE等相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組小鼠肝臟SREBP-1、FAS的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，CSE的mRNA表達(dá)水平及肝組織H2S含量顯著升高。內(nèi)源性H2S的含量會受到3個(gè)關(guān)鍵酶的影響，其中包括MPST和CSE[12-13]。本研究中，觀察組小鼠因注射AD-shRNA抑制MPST表達(dá)后，CSE表達(dá)反而上調(diào)，提示MPST與CSE之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，這一結(jié)果與Saghazadeh-Dezfuli等[14]的結(jié)果相符。另外，理論而言，MPST是H2S的生成酶，其下調(diào)會造成肝臟H2S含量的下降。然而，研究顯示，與對照組相比，隨著MPST表達(dá)的下調(diào)，觀察組肝臟H2S含量反而升高，提示MPST對H2S有負(fù)性調(diào)控作用，并且這種負(fù)性調(diào)控呈CSE依賴[15]。SREBP-1、FAS均為脂質(zhì)合成的相關(guān)蛋白，參與脂質(zhì)從頭合成過程。其中SREBP-1為中心轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)和活化肝臟TC、TG的合成酶，在脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。本研究中，觀察組小鼠肝臟的SREBP-1、FAS表達(dá)均低于對照組，提示MPST表達(dá)的下調(diào)也會抑制SREBP-1、FAS表達(dá)[17]。因此，分析MPST參與NAFLD的可能機(jī)制：隨著FFA的增加，肝臟MPST表達(dá)上調(diào)，通過MPST-CSE蛋白的相互作用負(fù)調(diào)控CSE表達(dá)，減少H2S生成，從而增強(qiáng)脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因SREBP-1及下游FAS表達(dá)，促進(jìn)肝臟FFA從頭合成增加，最終增加肝臟TG和TC沉積，加重肝臟脂肪變性，促進(jìn)NAFLD進(jìn)展[18]。

綜上所述，抑制MPST表達(dá)可減輕肝臟脂肪變性。MPST表達(dá)可通過對CSE的調(diào)控及對SREBP-1、FAS表達(dá)的作用影響脂肪變性，參與NAFLD進(jìn)展。