張?chǎng)┫迹惥秊?，?玨

0 引言

由于抗菌藥物長(zhǎng)期、大量使用，細(xì)菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(ESBLs)和碳青霉烯酶的陰性桿菌的大量出現(xiàn)，影響了其臨床應(yīng)用。產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌已在全球各地引起廣泛的流行播散[1-4]。中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)近10年耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果也顯示，臨床分離的肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南或美羅培南的耐藥率上升趨勢(shì)最明顯，由2005年的2.4%快速上升至2016年的18.6%[5]。

由于CRE菌株往往對(duì)絕大多數(shù)臨床常用抗菌藥耐藥，其所致感染常伴隨高病死率，使臨床的抗感染治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。開(kāi)發(fā)能夠克服肺炎克雷伯菌耐藥治療的手段以治療日益嚴(yán)峻的CRE所致感染迫在眉睫[6]。相關(guān)研究表明，碳青霉烯類藥物聯(lián)合其他抗菌藥物治療碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染與單獨(dú)使用碳青酶烯類藥物治療相比，聯(lián)合治療能夠顯著改善患者預(yù)后[7]。

痰熱清注射液(TRQ)是我國(guó)廣泛應(yīng)用的經(jīng)典復(fù)方制劑，由黃岑、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翅5種天然草本植物水溶性提取物組成，具有化痰解痙、鎮(zhèn)咳平喘的功效，同時(shí)具有廣譜抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]，且毒副作用小[10]。本研究針對(duì)目前臨床常見(jiàn)的產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，探討可用于臨床針對(duì)此類耐藥細(xì)菌所致感染的痰熱清注射液和碳青霉烯類抗生素聯(lián)合治療的新方案。

1 材料與方法

1.1 菌株 本研究選擇臨床分離的20株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，菌株均已通過(guò)質(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定，以PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序方法確認(rèn)碳青霉烯酶基因型別。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 藥敏試驗(yàn) 微量肉湯稀釋法測(cè)定痰熱清注射液和亞胺培南對(duì)肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度，實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果判讀參考2018年版CLSI文件標(biāo)準(zhǔn)[11]。棋盤(pán)法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，抑菌指數(shù)(Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)值的計(jì)算與判讀參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[14]。FIC=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨(dú)+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單獨(dú)。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用。

1.3 聯(lián)合殺菌曲線試驗(yàn) 根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，按文獻(xiàn)推薦方法進(jìn)行聯(lián)合殺菌試驗(yàn)[15-16]。操作步驟：將含1×105CFU/ml細(xì)菌的Mueller-Hinton肉湯與受試抗菌藥單藥或其聯(lián)合混合后于35 ℃大氣環(huán)境震蕩孵育，同時(shí)以無(wú)藥含1×105CFU/ml細(xì)菌的Mueller-Hinton肉湯作為生長(zhǎng)對(duì)照。在0、2、4、6、8、10、24 h分別取樣經(jīng)系列稀釋后涂布于Mueller-Hinton平板，35 ℃孵育過(guò)夜后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并繪制殺菌曲線圖。聯(lián)合藥物組的細(xì)菌存活數(shù)量較單藥降低 ≥ 2 log10CFU/ml判斷該兩藥組合具協(xié)同殺菌作用。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 20株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為100%，其MIC范圍分別為4～256 mg/L，對(duì)痰熱清注射液的MIC值為15.6～500 μl/ml。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，55%(11/20)的菌株對(duì)該兩藥組合呈協(xié)同作用，35%(7/20)的菌株呈相加作用，10%(2/20)的菌株為無(wú)關(guān)作用，所有菌株的聯(lián)合皆未產(chǎn)生拮抗作用(見(jiàn)表1)。

表1 20株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對(duì)痰熱清注射液和亞胺培南的MIC和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

2.2 聯(lián)合殺菌曲線試驗(yàn) 選取聯(lián)合藥敏中FIC值較低的菌株K7和K17進(jìn)行聯(lián)合殺菌曲線試驗(yàn)，結(jié)果顯示，這2株肺炎克雷伯菌在聯(lián)合殺菌曲線試驗(yàn)中亦表現(xiàn)為一致的聯(lián)合協(xié)同殺菌作用，菌株K7在兩藥聯(lián)合后的4 h即開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)合協(xié)同殺菌效應(yīng)，K17在兩藥聯(lián)合后的6 h開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)合協(xié)同殺菌效應(yīng)(見(jiàn)圖1、圖2)。在加藥10 h后，協(xié)同作用為最佳，其中菌株K7、K17聯(lián)合用藥的細(xì)菌數(shù)量較單藥痰熱清注射液和亞胺培南分別平均降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。

圖1 肺炎克雷伯菌K7的24 h殺菌曲線圖

圖2 肺炎克雷伯菌K17的24 h殺菌曲線圖

3 討論

近年來(lái)，產(chǎn)碳青霉烯酶的廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)給全世界健康衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于缺乏有效的抗菌藥物，導(dǎo)致臨床治療的失敗率和病死率增加[17-18]。研究表明，碳青霉烯類藥物聯(lián)合其他抗菌藥物治療碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染與單獨(dú)使用碳青酶烯類藥物治療相比[7]，能夠顯著改善患者預(yù)后，如與替加環(huán)素或多黏菌素[19-21]、與阿米卡星[22]以及與磷霉素的聯(lián)合[23]等均有報(bào)道，但很少有中藥和亞胺培南的聯(lián)合治療方案。痰熱清注射液治療肺炎克雷伯菌引起的感染具有很好的療效[24-25]。對(duì)痰熱清注射液治療社區(qū)獲得性肺炎臨床療效的Meta分析發(fā)現(xiàn)，痰熱清注射液與抗生素聯(lián)合治療CAP比單獨(dú)使用抗生素療效更好[26]。

肺炎克雷伯菌易形成生物膜，細(xì)菌一旦形成生物膜后，相比游離狀態(tài)的細(xì)菌，細(xì)菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性明顯降低，這是肺炎克雷伯菌易產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一[27-29]。有研究表明，痰熱清注射液能夠抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的形成[30]，與阿米卡星聯(lián)合用藥后對(duì)銅綠假單胞菌耐藥菌株的生物膜生長(zhǎng)具有抑制作用[31]。本研究通過(guò)對(duì)20株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌進(jìn)行的中西醫(yī)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，55% (11/20) 的菌株對(duì)痰熱清注射液和亞胺培南聯(lián)合呈現(xiàn)出協(xié)同作用，亞胺培南與痰熱清注射液聯(lián)合后，降低了亞胺培南的MIC值；部分菌株對(duì)亞胺培南單藥表現(xiàn)為耐藥，但與痰熱清注射液聯(lián)合后表現(xiàn)為敏感，如菌株K3、K12和K18。推測(cè)痰熱清注射液通過(guò)抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成，從而提高了亞胺培南的直接殺菌作用。

為了證實(shí)聯(lián)合藥敏的協(xié)同作用，本研究挑選了2株協(xié)同作用較好的菌株進(jìn)行殺菌曲線試驗(yàn)。結(jié)果顯示，殺菌曲線試驗(yàn)結(jié)果與聯(lián)合藥敏試驗(yàn)一致，也具有協(xié)同殺菌效應(yīng)，兩株菌株在加藥4～6 h開(kāi)始出現(xiàn)協(xié)同作用，在加藥10 h后，協(xié)同作用最佳，菌株K7和K17聯(lián)合用藥的細(xì)菌數(shù)量較單藥痰熱清注射液和亞胺培南分別降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。但是在24 h后菌落數(shù)發(fā)生了反彈，表明細(xì)菌并沒(méi)有完全殺滅。因此，我們建議臨床上可以通過(guò)縮短用藥時(shí)間來(lái)控制感染菌的復(fù)燃。

根據(jù)體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及聯(lián)合殺菌曲線來(lái)選擇用藥及確定給藥時(shí)間，一方面可以獲得預(yù)期的治療效果，為臨床提供精準(zhǔn)的治療方案；另一方面可以減少或避免單一用藥產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性。

僅依靠體外試驗(yàn)結(jié)果判斷聯(lián)合用藥的協(xié)同作用具有局限性，我們要建立相關(guān)感染動(dòng)物模型，探討聯(lián)合用藥方案在體內(nèi)治療產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌所致感染的有效性，觀察聯(lián)合用藥對(duì)動(dòng)物感染模型的毒副作用及安全性評(píng)價(jià)，為臨床針對(duì)該類耐藥細(xì)菌所致感染提供依據(jù)。