劉魏然，王宇喆，韓天壯，陳志忠，錢 亭，尹化斌

0 引言

肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一[1]，由于肝癌發(fā)病隱匿，絕大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了最佳的手術(shù)機(jī)會，需要進(jìn)行以化療為主或為輔的綜合治療。目前常用的化療藥物包括蒽環(huán)類、氟尿嘧啶及順鉑類等，但由于其毒副反應(yīng)大，患者的耐受性及敏感性差，因此尋找一種有效的化療藥物成為熱點。

組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor，HDACi)作為一種新的化療藥物，可以抑制組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)的活性，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出了強(qiáng)大的作用[2]。表觀遺傳學(xué)藥物FK228是一類由紫色色素桿菌產(chǎn)生、主要分布在細(xì)胞核內(nèi)、結(jié)構(gòu)獨特、高效、低毒、作用廣譜的雙環(huán)Ⅰ類HDACi[3]。目前,FK228已經(jīng)被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療外周及皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤。為此，我們研究了FK228對人肝癌細(xì)胞HepG2體內(nèi)外抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制，為臨床治療肝癌提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 實驗動物和細(xì)胞系 BALB/c裸鼠，4～5周齡，均為雄性，體重約14～16 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海國睿生命科技有限公司。人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 DMEN培養(yǎng)基為美國Sigma公司生產(chǎn)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為美國Gibco公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑為美國BD公司產(chǎn)品，CCK-8試劑盒和Matrigel基質(zhì)膠均購于上海勵韜生物科技有限公司，F(xiàn)K228購于上海陶素生化科技有限公司，5-FU購于上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。

2.2 細(xì)胞增殖檢測及藥物的半數(shù)抑制濃度測定 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以5×103個/100 μl接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實驗分為4組，F(xiàn)K228組、5-FU組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)。FK228組設(shè)1.25、2.5、5、10、20、40 μg/L 6個濃度梯度，5-FU組設(shè)6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml 6個濃度梯度，聯(lián)合組取5 μg/L的FK228和25 μg/ml的5-FU共同作用細(xì)胞，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。加藥后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后向每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞生長抑制率=(Ac-As)/(Ac-Ab)×100%，細(xì)胞存活率=1-細(xì)胞抑制率，其中Ac表示對照孔的吸光度值，As表示實驗孔的吸光度值，Ab表示空白孔的吸光度值，實驗重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞，用胰酶消化后吹打成細(xì)胞懸液，以每孔5×105個細(xì)胞接種于六孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實驗分4組：FK228組、5-FU組、聯(lián)合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，加藥后，將六孔板放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液。用遇冷的PBS洗滌2遍后，重懸細(xì)胞于Binding Buffer中，加入 FITC Annexin V 5 μl和PI 5 μl后，常溫下避光作用15 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

2.4 HepG2細(xì)胞荷瘤鼠模型的建立 5周齡左右的BALB/c裸鼠于右側(cè)腋窩皮下接種含Matrigel基質(zhì)膠的HepG2細(xì)胞混懸液(0.2 ml/只，5×107個HepG2細(xì)胞/ml)。待瘤塊長至一定大小后，處死荷瘤裸鼠。無菌條件下取出荷瘤鼠瘤塊，于無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffered saline，PBS)中剪成1～2 mm3小塊，再接種于20只裸鼠腋窩皮下，觀察接種情況。

2.5 體內(nèi)抑制實驗 待腫瘤體積長至100～150 mm3后，將成瘤的20只裸鼠隨機(jī)分成4組，即對照組、5-FU組、FK228組、聯(lián)合組，每組5只。分組當(dāng)天即給藥，5-FU組的給藥量為20 mg/kg，F(xiàn)K228組的給藥量為1 mg/kg，對照組給等量的含溶劑的生理鹽水，分別于第1、4、8、11天給藥；聯(lián)合組給藥量按照FK228和5-FU單藥組的劑量和頻率進(jìn)行給藥。給藥周期為21 d，每隔5 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，并計算腫瘤體積V=ab2/2，其中a表示腫瘤的長徑，b表示腫瘤的短徑。

2.6 免疫組化染色 21 d后處死裸鼠，立即取出裸鼠的腫瘤組織，用10%福爾馬林溶液進(jìn)行固定。將固定好的腫瘤組織進(jìn)行脫水、包埋成石蠟組織塊，將其制成切片后根據(jù)實驗步驟進(jìn)行caspase 3凋亡染色和CD31血管染色。凋亡的腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)會被染成棕黃色，每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選200倍視野進(jìn)行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，并且保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取照片中相同的棕黃色作為判斷陽性結(jié)果的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析，得出陽性的累積光密度(Integrated optical density，IOD)值。CD31表達(dá)于血管內(nèi)皮，腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)棕黃色顆粒。腫瘤的微血管密度(Micro-vessel density，MVD)分析參照Weidner 等校對計數(shù)方法，先在低倍光鏡下掃查整個切片，尋找3個血管高密度區(qū)，即“熱點”；然后在200倍光鏡下計數(shù)3個視野的血管數(shù)目平均值作為MVD值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件與Graphpad 6.0分析軟件進(jìn)行分析，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 單獨應(yīng)用FK228與5-FU和兩藥聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞HepG2生長的影響 FK228與5-FU對肝癌細(xì)胞HepG2均有明顯的生長抑制作用，且均呈劑量依賴性。見圖1。FK228的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(4.20±0.24)μg/L；5-FU的IC50值為(117.50±8.40)μg/ml，表面FK228在極低濃度對HepG2就有較強(qiáng)的殺傷力。將濃度為5 μg/L的FK228和25 μg/ml的5-FU聯(lián)合作用于細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228可以抑制細(xì)胞活性，且與單藥組相比，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率明顯減低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖1 FK228與5-FU對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用

圖2 FK228和5-FU單用與聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞HepG2的生長活性影響

3.2 FK228與5-FU聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228、5-FU單獨作用均可顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，且聯(lián)合用藥后細(xì)胞的總體凋亡率較單藥組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FK228與5-FU相比，兩藥對肝癌細(xì)胞HepG的體外促凋亡作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、圖4。

圖3 采用PI/Annexin V雙染法檢測肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的流式結(jié)果

圖4 采用PI/Annexin V雙染法檢測肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的流式結(jié)果

3.3 FK228對裸鼠皮下HepG2移植瘤的生長抑制作用 各組腫瘤治療后的體積變化如圖5所示，在治療后的第21天，F(xiàn)K228組、5-FU組、聯(lián)合給藥組及對照組的腫瘤體積分別為(344.71±118.87)、(351.97±73.46)、(220.36±72.12)、(639.76±241.47) mm3。FK228組、5-FU組、聯(lián)合給藥組的裸鼠腫瘤體積均小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明經(jīng)FK228的治療，裸鼠腫瘤的增長減慢，且聯(lián)合用藥后對裸鼠腫瘤的生長抑制作用更加明顯。

圖5 各治療組的裸鼠皮下肝癌體積隨時間變化曲線

3.4 FK228和5-FU聯(lián)合給藥促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的體內(nèi)凋亡及抑制腫瘤的血管生成 免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K228對肝癌細(xì)胞HepG2的體內(nèi)促凋亡作用并不明顯(P>0.05)，但與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，促凋亡作用較單獨用藥組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與對照組相比，F(xiàn)K228可以明顯抑制腫瘤內(nèi)的血管生成(P<0.05)；5-FU單獨使用時，其MVD值與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與FK228聯(lián)合后，可以明顯抑制腫瘤內(nèi)的血管生成。表明FK228與5-FU聯(lián)合用藥后，可能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡及抑制腫瘤的血管生成，從而抑制裸鼠皮下移植瘤的生長。見圖6、圖7。

4 討論

FK228因其特殊的縮酯環(huán)肽結(jié)構(gòu)，可有效透過細(xì)胞膜，通過抑制組蛋白去乙酰化酶抑制劑而發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管目前FK228僅被批準(zhǔn)用于淋巴瘤的治療，但對其他人癌細(xì)胞系的體外實驗和對人瘤嫁接物及鼠瘤的體內(nèi)實驗中，F(xiàn)K228均顯示了良好的抗腫瘤活性[4]。FK228的體外抗腫瘤作用極其顯著(IC50在納克水平)，研究已證明，F(xiàn)K228對多種腫瘤細(xì)胞如肺癌、肝癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等作用效果良好[5-10]。

圖6 各組腫瘤組織的caspase-3染色結(jié)果(200×)

圖7 各治療組腫瘤組織的CD31染色結(jié)果(200×)

本實驗通過CCK-8法證明了FK228與5-FU可以體外抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，呈劑量依賴性，且聯(lián)合用藥后細(xì)胞的生長抑制率明顯增加；5-FU對HepG2細(xì)胞48 h的IC50分別為(117.50±8.40)μg/ml，而FK228的IC50值為(4.20±0.24)μg/L。通過構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K228具有較強(qiáng)的體內(nèi)抑制HepG2移植瘤生長的作用，且與5-FU聯(lián)合應(yīng)用抑制作用明顯增加。

目前，HDACi發(fā)揮抗腫瘤的確切作用機(jī)制尚不明確，研究者普遍認(rèn)為HDACi通過抑制HDACs的活性，可以引起染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的改變，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，其中的一個重要機(jī)制就是引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[11-12]。研究表明，F(xiàn)K228可以引起多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，特別是與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥時[13-15]。Valdez等[15]將FK228與氟達(dá)拉濱、氯法拉濱、白消安聯(lián)合作用于淋巴瘤患者的PEER和SUPT1細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)與其他任何單藥、兩藥或三藥聯(lián)合相比，增加了FK228的四藥聯(lián)合，可通過引起組蛋白修飾、DNA損傷、降低谷胱甘肽的水平、增加活性氧產(chǎn)物的水平、下調(diào)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP1的表達(dá)及抑制多種生存信號途徑，從而對惡性T細(xì)胞表現(xiàn)出更加明顯的促進(jìn)凋亡和抑制生長作用。本研究分別通過體內(nèi)、外實驗證明了FK228可以引起肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，對肝癌細(xì)胞的體、內(nèi)外促凋亡作用明顯增強(qiáng)，但對促凋亡的機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。Sun等[16-20]研究表明，F(xiàn)K228可以通過激活Erk/MAPK途徑和JNK/MAPK途徑引起肝癌細(xì)胞的凋亡，且呈時間和濃度依賴性。越來越多的研究表明，HDACi可以通過降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)和提高宿主免疫功能而抑制腫瘤的血管生成，但目前仍不能確定這些生物學(xué)效應(yīng)對HDACi抗腫瘤是否起到關(guān)鍵的作用。本研究也證實了與對照組和5-FU組相比，F(xiàn)K228可以抑制裸鼠皮下HepG2肝癌內(nèi)的血管生成，但是對FK228是通過何種作用機(jī)制引起腫瘤內(nèi)的血管生成減少并未進(jìn)行深入研究，也不能確定抑制腫瘤的血管生成是否對FK228抗腫瘤起到關(guān)鍵的作用，因此仍需進(jìn)一步的探討。除此之外，F(xiàn)K228還可以通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)自體吞噬等，進(jìn)一步達(dá)到抗腫瘤的目的[21]。

總之，F(xiàn)K228與5-FU聯(lián)用一方面通過不同作用機(jī)制藥物的聯(lián)合提高肝癌對5-FU的敏感性，另一方面在保證療效的前提下，減少5-FU的用量，從而降低其毒副作用。本研究僅初步探討了FK228和5-FU聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞HepG2的體內(nèi)、外抑制作用，對兩藥聯(lián)合的不同形式、兩藥聯(lián)合最適合的劑量比及兩藥聯(lián)用的具體作用機(jī)制等還有待于進(jìn)一步研究。