宮藝其 楊禮 艾雪峰 顏冰倩 譚瑤 王會景 徐徐 付煒 王偉

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell，iPSC)是體細(xì)胞經(jīng)重編程后得到的具有自我更新及多向分化潛能的干細(xì)胞。2006年，Takahashi等[1]首次利用4種轉(zhuǎn)錄因子oct4、sox2、c-myc，klf4將小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，隨后又將人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[2]，從而避免了獲取胚胎干細(xì)胞所面臨的倫理問題，為體外研究各種疾病提供了理想的細(xì)胞來源。2013年，Lian等[3]利用小分子物質(zhì)GSK-3抑制劑及Wnt抑制劑，首次在體外高效分化得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞(Human induced pluripotent stem cell derived cardiac myocytes，hiPSC-CM)。目前，hiPSC-CM被用于建立疾病模型、心肌藥物篩選等[4-8]，還被用作細(xì)胞治療促進(jìn)心梗、心衰后的心功能恢復(fù)[9-11]。2018年，日本率先批準(zhǔn)臨床采用hiPSC-CM心肌片用于重癥心衰治療。然而，hiPSC-CM對于許多常見血管活性藥物的反應(yīng)仍不清楚。因此，本研究使用臨床常用的經(jīng)典血管活性藥物麻黃堿及阿托品，利用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察這些藥物對hiPSC-CM動作電位的影響，為臨床提供相關(guān)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

hiPSC：取自上海兒童醫(yī)學(xué)中心李彥欣教授課題組，為臍帶血細(xì)胞來源hiPSC。臍帶血捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)知情同意書。本研究經(jīng)上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審查批準(zhǔn)。

主要儀器：倒置相差顯微鏡(德國Leica公司DMI300B)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司3111)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司TSC SP8)，微電極拉制儀(美國sutter公司P97)，膜片鉗系統(tǒng)(美國Axon公司700B)。

主要試劑：基質(zhì)膠(美國Corning公司354234)，E8培養(yǎng)基(加拿大Stemcell公司05990)，EDTA(美國Thermo公司)，Accutase消化酶(加拿大Stemcell公司7920)，Y-27632(加拿大Stemcell公司72304)，RPMI1640(美國Thermo公司11875093)，B27 minus insulin添加劑(美國Thermo公司A1895601)，B27添加劑(美國Thermo公司17504044)，ChIR99021(加拿大Stemcell公司72054)，IWP-2(加拿大Stemcell公司72124)，心肌細(xì)胞消化液(北京賽貝生物技術(shù)公司CA2011007、CA2011008)，肌鈣蛋白ctnt抗體(美國Proteintech公司15513-1-AP)，肌球蛋白輕鏈mlc2v抗體(美國Proteintech公司10906-1-AP)，α-輔肌動蛋白α-actinin抗體(美國Sigma-Aldrich公司A7811)，tra-1-60抗體(德國Merck Millipore公司MAB4360)，oct4抗體(美國Epitomics公司2876-1)，sox2抗體(美國Epitomics公司2683-1)，nanog抗體(美國Epitomics公司3369-1)，HEPES(美國Sigma-Aldrich公司H3375-250G)，EGTA(上海麥克林公司E6257)，ATP鎂鹽(美國Sigma-Aldrich公司A9187-500MG)，鹽酸麻黃堿注射液(成都倍特藥業(yè)有限公司)，硫酸阿托品注射液(湖北興華制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1hiPSC傳代培養(yǎng)

在提前鋪好基質(zhì)膠的6孔板中使用E8培養(yǎng)基培養(yǎng)hiPSC，每24小時(shí)更換一次。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合后，使用5×10-4mol/L的EDTA在37 ℃下消化5 min，然后按1∶6～1∶9傳代至新的鋪好基質(zhì)膠的6孔板中。

1.2.2hiPSC心肌分化

使用Accutase消化酶將hiPSC消化成單個(gè)細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種于提前鋪好基質(zhì)膠的12孔板，待細(xì)胞完全融合，加入含12 μmol/L CHIR99021的RPMI1640/B27 minus insulin分化培養(yǎng)基。24 h后更換普通RPMI1640/B27 minus insulin培養(yǎng)基。48 h后，加入含5 μmol/L IWP-2的RPMI1640/B27 minus insulin分化培養(yǎng)基。48 h后更換普通RPMI1640/B27 minus insulin培養(yǎng)基。再過48 h更換RPMI1640/B27培養(yǎng)基，以后每48小時(shí)更換一次RPMI1640/B27培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，直至第30天。

1.2.3hiPSC干性鑒定

按1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度，將hiPSC接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板玻璃爬片上。待細(xì)胞融合至40%～50%時(shí)，室溫下4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100室溫破膜30 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，添加tra-1-60抗體、sox2抗體、nanog抗體、oct4抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗3遍后，添加相應(yīng)熒光二抗(1∶1 000)室溫避光孵育120 min。dapi(1∶1 000)室溫核染10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4hiPSC-CM鑒定

按1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度，將hiPSC-CM接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板玻璃爬片上，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后取出，室溫下4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100室溫破膜30 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，添加ctnt抗體、α-actinin抗體、mlc2v抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗3遍后，添加相應(yīng)熒光二抗(1∶1 000)室溫避光孵育120 min。dapi(1∶1 000)室溫核染10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5動作電位電極內(nèi)液、電極外液配制

電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 150，NaCl 5，CaCl22，EGTA 5，HEPES 10，MgATP 5(pH 7.2，KOH)；電極外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5，CaCl21，MgCl21，Glucose 10，HEPES 10(pH 7.4，NaOH)。

1.2.6hiPSC-CM動作電位檢測

在分化至第30天、含有4×104個(gè)hiPSC-CM的35 mm 孔徑培養(yǎng)皿中加入1 mL Accutase消化酶消化5 min，隨后通過“Y-tube”灌流裝置用動作電位電極外液灌流5 min。選取單個(gè)、細(xì)胞膜完整的心肌細(xì)胞作為記錄細(xì)胞。記錄電極用硅酸鹽毛細(xì)玻璃管由微電極拉制儀拉制而成，充入電極內(nèi)液后入液阻抗3～5 MΩ。當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜表面形成1 GΩ 以上的高阻封接后，吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償細(xì)胞膜電容，串聯(lián)電阻補(bǔ)償40%～50%，使用電流鉗gap free 模式記錄心肌細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的動作電位。隨后，通過“Y-tube”灌流裝置用含500 μmol/L麻黃堿、100 μmol/L阿托品的動作電位電極外液給藥5 min，記錄兩種血管活性藥物對心肌細(xì)胞動作電位的影響。用Clampfit 10和Origin 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hiPSC干性鑒定

iPSC在基質(zhì)膠上呈集落、克隆樣生長，免疫熒光染色顯示細(xì)胞核內(nèi)多能性標(biāo)志物oct4，sox2，nanog及細(xì)胞表面多能性標(biāo)志物tra-1-60，均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表明此iPSC細(xì)胞系多能性良好，可用于后續(xù)心肌分化(圖1)。

2.2 hiPSC心肌分化

將多能性良好的hiPSC按前述方法誘導(dǎo)心肌分化，觀察干細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中細(xì)胞的形態(tài)變化。干細(xì)胞從分化開始時(shí)的緊密圓形，逐漸變?yōu)樗缮E圓形的心肌前體細(xì)胞(Cardiac progenitor cell，CPC)，隨著分化進(jìn)行，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧鄢蓷l索狀的心肌細(xì)胞(Cardiomyocyte，CM)，并在第12天出現(xiàn)自發(fā)搏動，隨著分化時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸趨近成熟(圖2)。

2.3 hiPSC-CM鑒定

為了進(jìn)一步證明誘導(dǎo)分化得到的細(xì)胞為心肌細(xì)胞，我們通過心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物染色對其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。免疫熒光染色顯示，ctnt、α-actinin和mlc2v均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。證明經(jīng)過30 d分化，大部分細(xì)胞為相對成熟的心室肌細(xì)胞，可用于后續(xù)血管活性藥物對動作電位影響的實(shí)驗(yàn)(圖3)。

2.4 麻黃堿、阿托品對hiPSC-CM動作電位的影響

通過灌流系統(tǒng)對hiPSC-CM灌流動作電位電極外液。膜片鉗系統(tǒng)顯示，心肌細(xì)胞呈自發(fā)節(jié)律性動作電位，可見明顯2期平臺期，表明得到的細(xì)胞為心室肌細(xì)胞(圖4A、C，圖5A、C)。

通過同樣方法對hiPSC-CM灌流含500 μmol/L麻黃堿的動作電位電極外液。膜片鉗系統(tǒng)顯示，加藥后心肌細(xì)胞自發(fā)節(jié)律性動作電位頻率明顯增加(P=0.023)。動作電位波形無明顯改變，去極化幅度(APA)、最大去極化速率(dV/dtmax)和90%動作電位時(shí)程(APD90)相比加藥前無明顯變化(圖4，表1)。

A～C：oct4、dapi、merge免疫熒光；D～F：sox2、dapi、merge免疫熒光；G～I(xiàn)：nanog、dapi、merge免疫熒光；J～L：tra-1-60、dapi、merge免疫熒光(比例尺=25 μm) A-C: Immunofluorescence of oct4, dapi and the merge; D-F: Immunofluorescence of sox2, dapi and the merge; G-I: Immunofluorescence of nanog, dapi and the merge; J-L: Immunofluorescence of tra-1-60, dapi and the merge (Scale bar=25 μm)圖1 hiPSC細(xì)胞核多能性標(biāo)志物oct4、sox2、nanog和細(xì)胞膜多能性標(biāo)志物tra-1-60的表達(dá)Fig. 1 The expression of hiPSC nuclear pluripotency markers oct4, sox2, nanog and cell membrane pluripotency marker tra-1-60

A：hiPSC心肌分化模式圖；B：分化第0天；C：分化第6天；D：分化第12天；E：分化第30 天(比例尺=100 μm；CPC指心肌前體細(xì)胞；CM指心肌細(xì)胞) A: Schematic diagram of cardiac differentiation process of hiPSC; B: Cardiac differentiation on Day 0; C: Cardiac differentiation on Day 6; D: Cardiac differentiation on Day 12; E: Cardiac differentiation on Day 30 (Scale bar=100 μm; CPC refers to cardiac progenitor cells; CM refers to cardiomyocytes)圖2 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌分化過程Fig. 2 The cardiac differentiation process of hiPSC

A～D：ctnt、α-actinin、dapi、merge免疫熒光染色；E～G：mlc2v、dapi、merge免疫熒光染色(比例尺=100 μm) A-D: Immunofluorescence of ctnt, α-actinin, dapi and the merge; E-G: Immunofluorescence of mlc2v, dapi and the merge (Scale bar=100 μm)圖3 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源心肌細(xì)胞的鑒定Fig. 3 The identification of hiPSC-CM

同樣方法對hiPSC-CM灌流含100 μmol/L阿托品的動作電位電極外液。膜片鉗系統(tǒng)顯示，加藥后心肌細(xì)胞自發(fā)節(jié)律性動作電位頻率明顯增加(P=0.001)。動作電位波形無明顯改變，去極化幅度(APA)、最大去極化速率(dV/dtmax)和90%動作電位時(shí)程(APD90)相比加藥前無明顯變化(圖5，表2)。

A：對照組動作電位頻率；B：500 μmol/L麻黃堿組動作電位頻率；C：對照組單個(gè)動作電位波形；D：500 μmol/L麻黃堿組單個(gè)動作電位波形 A: The frequency of spontaneous action potential of the control group; B: The frequency of spontaneous action potential of the 500 μmol/L ephedrine group; C: Representative action potential trace of the control group; D: Representative action potential trace of the 500 μmol/L ephedrine group圖4 麻黃堿對人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源心肌細(xì)胞動作電位的影響Fig. 4 Effects of ephedrine on action potential of hiPSC-CM

A：對照組動作電位頻率；B：100 μmol/L阿托品組動作電位頻率；C：對照組單個(gè)動作電位波形；D：100 μmol/L阿托品組單個(gè)動作電位波形。 A: The frequency of spontaneous action potential of the control group; B: The frequency of spontaneous action potential of the 100 μmol/L atropine group; C: Representative action potential trace of the control group; D: Representative action potential trace of the 100 μmol/L atropine group.圖5 阿托品對人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源心肌細(xì)胞動作電位的影響Fig. 5 Effects of atropine on action potential of hiPSC-CM

表1 500 μmol/L麻黃堿對hiPSC-CM動作電位的影響Table 1 Effect of 500 μmol/L ephedrine on action potential of hiPSC-CM

表2 100 μmol/L 阿托品對hiPSC-CM動作電位的影響Table 2 Effect of 100 μmol/L atropine on action potential of hiPSC-CM

3 討論

本研究結(jié)果表明：所使用的hiPSC表達(dá)多能性標(biāo)志，干性良好，經(jīng)小分子誘導(dǎo)分化后獲得的hiPSC-CM高表達(dá)ctnt、mlc2v等心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，且具有自發(fā)節(jié)律性動作電位。麻黃堿、阿托品可明顯增加hiPSC-CM動作電位頻率，而對RMP、APA、dV/dtmax、APD90無明顯影響。

用于實(shí)驗(yàn)的hiPSC-CM均為分化大于30 d的細(xì)胞，Burridge等[12]認(rèn)為hiPSC-CM隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，心室肌細(xì)胞比例會逐漸增加，在肌原纖維、肌節(jié)形成以及電生理等方面均會趨近成熟。本研究對分化30 d得到的hiPSC-CM進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及電生理的鑒定，發(fā)現(xiàn)所得到的細(xì)胞高表達(dá)心室肌特異性標(biāo)志物mlc2v，且動作電位有明顯的2期平臺期，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是，RMP、APA等與以往文獻(xiàn)略有差異[13]，分析后認(rèn)為可能是以下原因：①所使用的iPSC細(xì)胞系不同；②記錄時(shí)液面波動導(dǎo)致記錄不穩(wěn)定；③記錄時(shí)間略長導(dǎo)致細(xì)胞活性略有下降。提示不同細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)時(shí)長可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

麻黃堿、阿托品是臨床常用的血管活性藥物，通過激動心肌細(xì)胞腎上腺素能受體或抑制乙酰膽堿受體而發(fā)揮作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到麻黃堿、阿托品使hiPSC-CM動作電位頻率明顯加快，但動作電位波形無明顯變化，與Calvert等[14]及Gizurarson等[15]使用人或小鼠心肌細(xì)胞系觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示hiPSC-CM具有良好的藥物反應(yīng)性，與在體心肌細(xì)胞相似。

綜上所述，hiPSCs通過體外小分子分化，可獲得大量心肌細(xì)胞，麻黃堿、阿托品能夠明顯加快hiPSC-CM自發(fā)動作電位頻率，對動作電位波形無明顯影響。本研究證明了hiPSC-CM具有良好的藥物反應(yīng)性，為hiPSC-CM的臨床應(yīng)用及相關(guān)藥物治療提供了證據(jù)。