代冬 馮小東

口腔黏膜是由口腔上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的黏膜屏障系統(tǒng)，可有效抵御病原體，是維護口腔健康的第一道屏障[1]。然而，口腔黏膜常受到局部物理性傷害，引發(fā)破損、潰瘍等損傷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜創(chuàng)面形成后可激活固有免疫細(xì)胞，如單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，并產(chǎn)生大量炎癥因子，引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)[3-5]。其中，TGF-β在促進口腔黏膜重建和修復(fù)的過程中發(fā)揮了重要作用[3，6-7]。TGF-β可通過刺激口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移以促進傷口修復(fù)，但對口腔黏膜成纖維細(xì)胞活性的調(diào)控機制還不完全清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源基因表達的非編碼RNA，可通過與下游靶基因的mRNA形成特定的配對位點，調(diào)控下游基因的表達水平，影響多種細(xì)胞生理活動[8]。miR-200a是miR-200家族中的主要成員，在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有重要作用[9]，但是否參與口腔黏膜修復(fù)和重建的調(diào)控還不清楚。本研究利用人牙齦成纖維細(xì)胞(Human Gingival Fibroblast，HGF)，對TGF-β誘導(dǎo)口腔黏膜修復(fù)過程中miR-200a的表達及功能進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Trypsin-EDTA胰酶消化液(ThermoFisher公司，美國)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；重組人轉(zhuǎn)化生長因子β(R&D公司，美國)；Lipofectmine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol(Invitorgen公司，美國)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(同仁化學(xué)，日本)，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室(BD公司，美國)。

1.2 健康牙齦標(biāo)本采集及原代HGF培養(yǎng)

收集本院口腔科因手術(shù)拔除阻生第三磨牙而切除的牙齦組織。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤30周歲；②無口腔癌和牙周??；③無全身系統(tǒng)性疾病。手術(shù)切除的新鮮牙齦組織以4 ℃預(yù)冷的含有1%青霉素-鏈霉素的HBSS沖洗，去除殘留血凝塊，并用眼科剪修剪成為5 mm3大小的方塊，隨后加入1 U/mL的Dispase Ⅱ分散酶，置于4 ℃冰箱中靜置16 h。次日，小心分離牙齦組織的表皮層、血管等組織，加入0.25%Trypsin-EDTA，放置于37 ℃培養(yǎng)箱消化30 min后，加入胎牛血清終止消化，1 000 r/min離心5 min，使用含有10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，培養(yǎng)于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞充分貼壁后換液，去除懸浮的組織碎片。每天換液，每3天傳一代。第3代HGF用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞總RNA提取

第3代HGF分別加入終濃度0、5、10、20、40 ng/mL的重組人TGF-β處理24 h，經(jīng)Trypsin-EDTA消化分離細(xì)胞，加入500 μL TRIzol，室溫靜置20 min，隨后加入100 μL三氯甲烷，充分混勻后12 000 g離心10 min，取200 μL上清，加入等體積異丙醇，12 000 g離心10 min，沉淀的總RNA用70%乙醇清洗2遍，晾干后加入50 μL DEPC水充分溶解。

1.4 實時熒光定量PCR

取0.5 μg總RNA，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后使用羅氏SYBR Green qPCR Mix，以逆轉(zhuǎn)錄方式得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。對miR-200a的定量檢測使用U6為對照內(nèi)參，反應(yīng)所需的引物序列為：miR-200a正向引物5’-CCTACGCCACAATTAACAAGCC-3’；miR-200a反向引物5’-GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6反向引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3’。

1.5 實驗分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將第3代HGF分為空白組、對照組和實驗組。對照組和實驗組均加入20 ng/mL TGF-β預(yù)處理12 h，隨后對照組轉(zhuǎn)染隨機序列miRNA，實驗組轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物，空白組不予TGF-β刺激及轉(zhuǎn)染操作。miRNA的轉(zhuǎn)染使用Lipofectmine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，miRNA及轉(zhuǎn)染試劑使用量參照轉(zhuǎn)染試劑操作說明，依據(jù)每次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)確定。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實驗

Transwell小室預(yù)先加入500 μL終濃度為10 μg/mL的Fibronectin溶液于24孔板中，讓小室下層基底膜充分接觸Fibronectin溶液，37 ℃孵育2 h。隨后將小室取出，PBS清洗2次。將各組細(xì)胞消化并使用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，上層小室加入200 μL細(xì)胞懸液，下層小室加入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)18 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦拭上層小室中未遷移的細(xì)胞，然后將小室基底膜放置于4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定15 min，PBS清洗后結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS清洗3次，小心取下基底膜，鏡下觀察拍照，并統(tǒng)計每個視野中遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.7 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

空白組、對照組和實驗組HGF消化離心并重懸，取2×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞充分貼壁后，于0 h、24 h和48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

離心收集HGF，用預(yù)冷的PBS清洗1遍，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，待樣品冷卻后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，后轉(zhuǎn)到0.45 μm PVDF膜上。轉(zhuǎn)印蛋白樣品的PVDF膜先用5%脫脂牛奶封閉40 min，后依次孵育一抗和HRP偶聯(lián)的二抗各1 h后，加入顯色底物，使用凝膠成像儀獲取顯影圖像，使用Gel Pro軟件對蛋白顯影條帶進行灰度值定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF-β對HGF中miR-200a表達的影響

與無TGF-β處理組(0 ng/mL)相比，TGF-β處理的HGF中miR-200a表達水平顯著下降，且隨著TGF-β作用濃度提高，表達下降比例增加，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)(圖1)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染對HGF中miR-200a表達水平的影響

與空白組相比，對照組miR-200a表達水平顯著下降(P<0.05)；與對照組細(xì)胞相比，實驗組miR-200a表達水平顯著上升(P<0.05)(圖2)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖2 各組細(xì)胞miR-200a表達水平比較Fig. 2 The expression level of miR-200a in each group

2.3 過表達miR-200a對HGF增殖活性的影響

與空白組相比，經(jīng)TGF-β處理的對照組HGF在24 h和48 h時間點檢測的細(xì)胞增殖活性顯著上升(P<0.05)；而與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的實驗組HGF在24 h和48 h檢測的細(xì)胞增殖活性顯著下降(P<0.05)(圖3)。

a：與同一時間點空白組相比，P<0.05；b：與同一時間點對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group at the same time point, P<0.05; b: compared with control group at the same time point, P<0.05圖3 各組細(xì)胞增殖活性分析Fig. 3 The proliferation activity of HGF cells in each group

2.4 過表達miR-200a對HGF遷移能力的影響

與空白組相比，對照組HGF遷移到下層小室的數(shù)量明顯上升(P<0.05)；與對照組相比，實驗組HGF遷移到下層小室的數(shù)量明顯下降(P<0.05)，表明過表達miR-200a會影響細(xì)胞遷移(圖4)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖4 Transwell實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力Fig. 4 The migration capability of HGF cells in each group

2.5 過表達miR-200a對HGF中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達的影響

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果表明，與空白組相比，對照組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達水平均顯著上升(P<0.05)；與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的實驗組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達水平均顯著下降(P<0.05)(圖5)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖5 各組細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達水平Fig. 5 The expression levels of collagen Ⅰ and Ⅲ in each group

3 討論

創(chuàng)面愈合是皮膚、黏膜等在損傷后自發(fā)進行的一系列自我保護的生理過程，機體各個組織的創(chuàng)面愈合過程基本一致，都涉及到炎癥反應(yīng)、組織再生等生理活動，并且通過一個快速的修復(fù)過程避免機體的進一步損害，這一過程被高度有序地調(diào)控，然而其調(diào)控機制還不清楚[10]。口腔黏膜由于處于富含微生物的濕潤環(huán)境中[2]，其創(chuàng)面愈合重建的過程與皮膚相比可能有不同的調(diào)控機制。研究發(fā)現(xiàn)，miR-2053可以通過影響Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白以及金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3的表達，影響HGF的遷移和增殖，進而影響口腔黏膜修復(fù)[11]。

口腔黏膜創(chuàng)傷愈合過程中，炎癥因子發(fā)揮了重要的作用[6]。研究表明，口腔黏膜損傷后TGF-β表達水平上升，但其參與口腔創(chuàng)傷愈合和黏膜重建的機制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在20 ng/mL TGF-β處理后，HGF的miR-200a表達水平下調(diào)，提示miR-200a可能在TGF-β信號通路下游發(fā)揮了重要作用。TGF-β在腫瘤和炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮了重要的作用，但對細(xì)胞功能的調(diào)控作用在不同組織中或疾病的不同階段都不盡相同。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過胞漿蛋白Smad的磷酸化介導(dǎo)的，TGF-β與膜受體結(jié)合，促進Smad蛋白發(fā)生磷酸化修飾，Smad蛋白N端MH1結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合功能，而C端MH2結(jié)構(gòu)域則可以與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活TGF-β下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)錄[12]。關(guān)于TGF-β下游信號通路與miRNA的研究表明，TGF-β在促進或抑制某些miRNA的成熟中發(fā)揮了重要作用[13-14]。miR-200家族包括5個成員，即miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。研究顯示，在TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，miR-200家族成員的表達都顯著下調(diào)。miR-200a可以抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1和ZEB2的表達，TGF-β通過下調(diào)miR-200a并增加ZEB2的表達水平，促進腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤[15-16]。口腔黏膜修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞通過自身增殖、遷移來促進創(chuàng)口愈合，并通過表達膠原蛋白以促進基質(zhì)的重建。在該過程中，TGF-β可以促進成纖維細(xì)胞的增殖和遷移、調(diào)控炎癥反應(yīng)、促進血管新生并促進膠原蛋白合成以重建細(xì)胞外基質(zhì)，對口腔黏膜修復(fù)發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF過表達miR-200a可以顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，并可以抑制牙齦成纖維細(xì)胞表達Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白。這些結(jié)果提示，在口腔黏膜修復(fù)過程中，miR-200a可以作為TGF-β信號通路重要的調(diào)控因子，影響牙齦成纖維細(xì)胞的功能。本研究為揭示TGF-β調(diào)控口腔黏膜修復(fù)重建的機制提供了新的研究基礎(chǔ)。