吳萬豐 程誠 聶慧芳 孫藝航 羅寧 蔣成婷 成紹武 葛金文

〔摘要〕 目的 探討補陽還五湯在氣虛血瘀證缺血中風大鼠腸道微生態(tài)環(huán)境下藥物成分的吸收。方法 采用力竭游泳法聯(lián)合線栓法建立氣虛血瘀證缺血中風大鼠模型，模型組與假手術組大鼠同時于術后1 h、24 h及48 h灌胃補陽還五湯，兩組大鼠均于術后72 h取盲腸糞便行16S rRNA基因測序檢測腸道菌群，采集分離血漿后運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學方法檢測血漿代謝物，對腸道菌群及血漿代謝產(chǎn)物進行組間差異分析及關聯(lián)分析。結(jié)果 兩組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)及血漿代謝輪廓存在明顯差異，與假手術組比較，缺血中風氣虛血瘀證大鼠中甜菜堿、α-紫羅蘭酮、甲基沒食子酸-O-硫酸鹽、阿拉伯糖、棕櫚酸、紫花前胡醇顯著上調(diào)（P<0.05），阿糖腺苷、3-O-甲基沒食子酸顯著下調(diào)（P<0.05）。除3-O-甲基沒食子酸外，上述其他7種藥物成分的組間差異均與腸道菌群有相關性。結(jié)論 氣虛血瘀證缺血中風大鼠腸道菌群差異影響補陽還五湯藥物成分在腸道的吸收。

〔關鍵詞〕 缺血中風;氣虛血瘀證;補陽還五湯;腸道菌群;代謝產(chǎn)物

〔中圖分類號〕R285.5;R255.2 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.005

〔Abstract〕 Objective To explore the absorption of drug components of Buyang Huanwu Decoction under the intestinal micro-ecological environment of rats with ischemic stroke of Qi deficiency and blood stasis syndrome. Methods We established the rat models of Qi deficiency and blood stasis syndrome of ischemic stroke by exhausting swimming method combined with thread embolism. The model group and the sham operation group were gavaged with Buyang Huanwu Decoction at 1 h， 24 h and 48 h after operation. After 72 hours， cecal feces samples were taken for 16S rRNA gene sequencing. After collection and separation of plasma， non-targeted metabolomics of liquid chromatography-mass spectrometry was used to detect plasma metabolites. Difference analysis and correlation analysis of intestinal flora and plasma metabolites were performed. Results There were significant differences between the 2 groups in the gut microbiota composition structure and the plasma metabolic profiles. Betaine， α-ionone， methyl gallic acid-O-sulfate， arabinose， palmitic acid， decursinol in rat models of Qi deficiency and blood stasis syndrome of ischemic stroke were significantly up-regulated（P<0.05）， and vidarabine， 3-O-methyl gallic acid were significantly down-regulated（P<0.05）. In addition to 3-o-methyl gallic acid， the differences of other 7 drug components were correlated with gut microbiota. Conclusion The difference of gut microbiota in rats with Qi deficiency and blood stasis syndrome of ischemic stroke affected absorption of Buyang Huanwu Decoction in intestinal tract.

〔Keywords〕 ischemic stroke; Qi deficiency and blood stasis syndrome; Buyang Huanwu Decoction; gut microbiota; metabolites

人體胃腸道寄生著大量的微生物，菌群種類達到1 000多種，在維持人體正常生理中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。腸道菌群參與機體物質(zhì)代謝，如飲食中的多糖、膽汁酸的代謝及維生素、氨基酸的合成[3-4];腸道菌群中含有部分藥物代謝酶，參與許多中西藥成分的轉(zhuǎn)化代謝[5];腸道菌群參與腸黏膜屏障的形成及維持[6]，影響藥物的吸收。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀證缺血中風組與氣滯血瘀證缺血中風組、大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）組及假手術組大鼠之間有著不同的腸道菌群組成，提示腸道菌群可能參與氣虛血瘀證缺血中風證候的形成，那么腸道菌群是否參與補陽還五湯藥物成分的代謝吸收？本文通過建立具有不同腸道微生態(tài)環(huán)境的大鼠模型，灌胃補陽還五湯干預72 h后，采用16S rRNA基因測序檢測腸道菌群聯(lián)合超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）檢測血漿代謝產(chǎn)物的方法，探討腸道菌群對補陽還五湯代謝及吸收的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 ?實驗動物

7～9周齡SD雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量240～270 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院動物實驗中心，動物許可證號：SYXK（湘）2015-0003，濕度45%～65%，室溫25 ℃，自由飲水，攝食。

1.2 ?藥品

補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》，處方組成為：黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g。飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。

1.3 ?主要試劑與儀器

MCAO栓線-2634A4（北京西濃科技有限公司，中國）;E.Z.N.A糞便DNA提取試劑盒（安諾倫生物科技有限公司，美國）。QuantiFluorTM熒光計（普洛麥格生物技術有限公司，美國）;Hiseq2500 PE250測序系統(tǒng)（Illumina公司，美國）;超高效液相1290 UHPLC（安捷倫科技有限公司，美國）;高分辨質(zhì)譜Triple TOF 5600（美國應用生物系統(tǒng)公司，美國）。

2 方法

2.1 ?藥品制備

將補陽還五湯處方飲片混合，用3倍體積蒸餾水先浸泡2 h，武火煮沸0.5 h，文火慢煎1 h，然后過濾收集濾液，按上述步驟再次提取濾液1次，將兩次濾液混合后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮中藥水提液，最終藥物生藥濃度為2 g/mL。

2.2 ?氣虛血瘀證缺血中風大鼠模型制備

參照張錦等[7]研究方法，將大鼠按4.0%±0.5%質(zhì)量負重后放進內(nèi)徑150 cm、水深40 cm的圓形游泳池，水溫控制在（20±1） ℃，強迫其不停游泳直至力竭后撈出，力竭指征為游泳動作失調(diào)、水淹沒鼻尖、身體下沉超過10 s不能浮出水面。先適應性游泳訓練3 d，然后每天力竭性游泳1次，持續(xù)21 d，于實驗第22天采用改良的線栓法制備大鼠MCAO模型[8]，阻塞右側(cè)大腦中動脈，大鼠手術麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標準。最終制備氣虛血瘀證缺血中風大鼠模型。大鼠腦缺血期間保持體溫在（37.0±0.5） ℃。

假手術組大鼠不予游泳，常規(guī)飼養(yǎng)，與氣虛血瘀證缺血中風大鼠于同日按照改良線栓法制作MCAO模型的方法分離血管，但不插入栓線，然后縫合。

2.3 ?動物分組干預及標本采集處理

將大鼠分為假手術組（sham operation group， SOG）和氣虛血瘀證缺血中風組（Qi deficiency and blood stasis syndrome of ischemic stroke group，QDBSG），兩組大鼠分別為8只和12只。QDBSG大鼠手術蘇醒后經(jīng)神經(jīng)行為學評分確定模型成功后與SOG大鼠同時開始給予補陽還五湯灌胃，給藥時間點分別為術后1 h、24 h及48 h，給藥劑量為12 mL/kg（按體表面積計算，相當人臨床等效劑量的2倍，12.87 g/kg）。所有大鼠于手術后72 h用水合氯醛35 mg/kg腹腔麻醉，用5 mL肝素鈉抗凝管腹主動脈采血，立即3 000 r/min離心15 min分離血漿，1.5 mL EP管留存血漿于-80 ℃冰箱保存;用15 mL滅菌離心管收取盲腸內(nèi)容物儲存于-80 ℃冰箱。上述標本均用干冰填埋轉(zhuǎn)運至廣州基迪奧生物科技有限公司分別檢測血漿代謝產(chǎn)物及腸道菌群。

2.4 ?16S rRNA基因測序

按E.Z.N.A糞便DNA試劑盒說明的步驟從兩組每只大鼠的盲腸內(nèi)容物中分別提取總DNA，用帶有barcode的特異引物（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3';806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（Vazyme Biotech Co.， Ltd）擴增 DNA 樣本中16S rDNA的V3-V4區(qū)。進行兩輪PCR擴增，第一輪PCR以總DNA為模板，擴增條件為：94 ℃預變性2 min，接著98 ℃10 s、62 ℃30 s、68 ℃30 s30個循環(huán)，最后68 ℃延伸5 min。將第一輪擴增的產(chǎn)物純化后進行第二輪PCR反應，反應條件為94 ℃預變性2 min，接著98 ℃10 s、65 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s15個循環(huán)，最后68 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物切膠回收后從2%瓊脂糖凝膠中提取并純化，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機測序。

2.5 ?UPLC-MS檢測代謝產(chǎn)物

從每只大鼠血漿樣本中取100 μL，加入400 μL含有內(nèi)標（L-2-氯苯丙氨酸）的提取液（甲醇乙腈體積比=1∶1，內(nèi)標濃度1 mg/mL），渦旋混勻30 s，超聲5 min（冰水浴），-20 ℃靜置1 h，將樣本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心地取出425 μL上清于 EP 管中，在真空濃縮器中干燥提取物，向干燥后的代謝物加入100 μL提取液（乙腈水體積比=1∶1）復溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min，將樣本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心地取出60 μL上清液于2 mL進樣瓶，每個樣本各取10 μL混合成質(zhì)控樣本，再取60 μL上機進行UPLC-MS代謝組學分析。

色譜柱為UPLC HSS T3（2.1 mm×200 mm，1.7 μm），進樣體積為3 μL，流動相A為水（含有25 mmol/L的醋酸銨及25 mmol/L的氨水），流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～7 min，95%B;7～8 min，65%B;8～9.1 min，40%B;9.1～12 min，95%B。流速500 μL/min。

質(zhì)譜條件：AB 6600 Triple TOF質(zhì)譜儀在控制軟件（Analyst TF 1.7， AB Sciex）控制下基于IDA功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，每50 ms采集15張二級譜圖。ESI離子源參數(shù)設置如下：霧化氣壓（GS1）：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V（正離子模式）或-4000 V（負離子模式）。

2.6 ?16S rRNA基因測序生物信息學分析

測序得到raw reads之后，對低質(zhì)量reads進行過濾，然后進行組裝和過濾，使用Uparse（usearch v9.2.64）軟件按照一致性>97%將測序序列聚類成為分類操作單元（operational taxonomic units， OTUs），依次用RDP Classifier（version 2.2），與Greengene或SLIVA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋（設定置信度的閾值為 0.8～1），用QIIME軟件計算樣本α多樣性指標及β多樣性指標，采用t檢驗進行兩兩比較分析組間差異，P<0.05提示有統(tǒng)計學意義。

2.7 ?非靶向代謝組學數(shù)據(jù)分析

使用ProteinWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式，使用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫與軟件自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性;利用歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣進行多元統(tǒng)計分析（PCA分析、PLS-DA分析、OPLS-DA分析）;利用多元統(tǒng)計分析OPLS-DA和單變量統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法篩選差異代謝物。

2.8 ?腸道菌群與血漿代謝產(chǎn)物相關性分析

為了整合腸道微生物群和代謝組學數(shù)據(jù)，進行O2PLS分析。利用代謝物豐度數(shù)據(jù)集和微生物區(qū)系各分類水平的數(shù)據(jù)集（包括門級和屬級），建立O2PLS模型。計算O2PLS模型，利用R語言中OmicsPLS包開展O2PLS分析。為了探索微生物群與代謝組學之間的關系，用R語言（3.5.1版）計算微生物群在門和屬水平與代謝組學數(shù)據(jù)集之間的Pearson相關系數(shù)。在R語言中使用Pheatmap生成相關熱圖，用Igraph進行網(wǎng)絡分析。

3 結(jié)果

3.1 ?兩組大鼠灌胃補陽還五湯后腸道菌群差異比較

3.1.1 ?腸道菌群多樣性差異分析 ?QDBSG大鼠術后72 h內(nèi)死亡4只，有效取材每組各8只，死亡原因考慮為大腦中動脈阻塞后大面積腦梗死相關，SOG無大鼠死亡，有效取材8只。對QDBSG及SOG大鼠進行腸道菌群α多樣性分析，結(jié)果顯示：兩組間Chao、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)均無顯著性差異（表1），提示兩組腸道菌群物種豐富度及均勻度無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。進一步進行β多樣性分析，在OTU水平上基于Bray-Curtis距離開展PCoA主坐標分析，并經(jīng)T檢驗發(fā)現(xiàn)兩組腸道菌群群落組成有顯著性差異（圖1-A，P=0.000 2），ANOSIM檢驗進一步證實兩組間樣本組間差異顯著大于組內(nèi)差異（圖1-B，Bray-Curtis，R=0.769，P=0.002）。

3.1.2 ?腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異分析 ?在腸道菌群屬分類水平進行了差異物種分析，物種分類堆疊圖可見兩組物種豐度存在差異（圖2-A），經(jīng)Welchs T檢驗證實兩組間有20個菌屬存在顯著性差異（P<0.05），與SOG比較，QDBSG有10個菌屬豐度顯著升高，10個菌屬豐度顯著降低，QDBSG中Bacteroides、Alloprevotella、Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Butyricimonas等菌屬豐度顯著升高，而Lactobacillus、Helicobacter、Tyzzerella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminiclostridium_9等菌屬豐度顯著降低（圖2-B）。綜上可見，兩組大鼠灌胃補陽還五湯后腸道菌群組成存在顯著性差異。

3.2 ?兩組大鼠補陽還五湯相關血漿代謝產(chǎn)物存在差異

利用正交最小偏二乘判別分析（OPLS-DA）方法分析代謝組學數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在正離子模式（positive ionmode，POS）和負離子模式（negative ion mode，NEG）兩種電離模式下，QDBSG與SOG大鼠經(jīng)補陽還五湯干預后血漿代謝輪廓存在很大差異，交叉驗證證實模型穩(wěn)定可靠，無過度擬合（正離子模式：R2Y=0.925，Q2Y=0.778;負例子模式：R2Y=0.968，Q2Y=0.857）。差異代謝物聚類熱圖直觀地顯示出兩組正、負離子模式下的代謝產(chǎn)物的聚類差異（圖3-A、3-B）。

結(jié)合多元統(tǒng)計分析OPLS-DA的VIP值和單變量統(tǒng)計分析t檢驗P值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物，顯著差異的閾值為：VIP≥1且T-test P<0.05[9]。在POS和NEG模式下分別檢測到154和151個明顯失調(diào)的代謝物。與SOG比較，QDBSG大鼠POS模式下有64個代謝產(chǎn)物上調(diào)，90個代謝產(chǎn)物下調(diào)，NEG模式下有77種代謝產(chǎn)物上調(diào)，74種代謝產(chǎn)物下調(diào)。這些失調(diào)的代謝產(chǎn)物中，將已經(jīng)被鑒定出的代謝產(chǎn)物與上海有機所中藥和化學成分數(shù)據(jù)庫中補陽還五湯組成藥物的有效成分進行比對，發(fā)現(xiàn)8種中藥代謝成分存在著顯著性差異（表2）。綜上可見，補陽還五湯藥物成分的吸收在QDBSG與SOG大鼠之間存在明顯差異。

3.3 ?補陽還五湯差異血漿代謝物與腸道菌群相關

為了明確不同處理組之間補陽還五湯血漿代謝物差異與腸道菌群之間的關系，利用O2PLS模型關聯(lián)分析腸道菌群與血漿代謝產(chǎn)物之間的相關性。通過計算皮爾遜相關系數(shù)（cor）得到相關矩陣，發(fā)現(xiàn)上述補陽還五湯相關的血漿代謝產(chǎn)物中有7個代謝物與腸道菌群之間存在顯著相關性（cor>0.5或cor<-0.5，P<0.05），見表3，提示不同腸道微生態(tài)環(huán)境中補陽還五湯藥物成分的吸收存在著差異，腸道菌群參與補陽還五湯藥物在腸道的吸收。

4 討論

中藥與腸道菌群之間的作用是相互的，中藥可以引起腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，腸道微生物可以通過多個途徑影響藥物的代謝及吸收[10-11]，主要表現(xiàn)為促進其人體吸收、增強藥物療效及參與毒性成分轉(zhuǎn)化等方面。中藥中有許多成分無法被胃腸道直接吸收利用，或者口服利用度低下，如多糖、皂苷類、多酚類等，而腸道菌群可參與其轉(zhuǎn)化代謝，促進其吸收，提高生物利用度，如人參皂苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化生成化合物K，從而更好的被吸收入血，并表現(xiàn)出更有效的藥理作用[12]。Eu-bacterium菌能夠?qū)o致瀉作用的蘆薈大黃素苷代謝為aloe-emodin-9-anthrone，后者有顯著的致瀉作用[13]。Bacteroidetes的β-葡糖苷酶能將苦杏仁苷轉(zhuǎn)化為氫氰酸，從而可能引起毒性反應[14]。

腸道菌群也參與補陽還五湯的代謝。葉肖栗等[15]通過HPLC法發(fā)現(xiàn)腸道菌群對補陽還五湯的4個主要成分具有較強的代謝作用，在菌群作用下毛蕊異黃酮苷和刺芒柄花苷迅速脫糖而成為苷元，造成2個苷元含量的迅速升高，苷元的含量在短時間內(nèi)達到最大值后開始慢慢下降，證明菌群對苷元也具有較強的代謝能力。Ruina Zhou等[16]也證實黃芪甲苷經(jīng)大鼠腸道菌群代謝，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為皂苷元及皂苷元異構(gòu)體。藥菌共孵育方法證實沒食子酸在大鼠腸道細菌各種酶的作用下發(fā)生脫羧和甲基化反應[17]。但補陽還五湯作為用于治療缺血中風氣虛血瘀證的代表方，其在缺血中風氣虛血瘀證特定的腸道微生態(tài)環(huán)境下的代謝及吸收情況如何，其腸道菌群的差異是否是辨證使用補陽還五湯的生物學基礎之一，均有待于進一步研究。

本研究表明，缺血中風氣虛血瘀證大鼠與假手術組大鼠經(jīng)補陽還五湯干預后兩組間腸道菌群組成結(jié)構(gòu)存在顯著性差異，證實兩組間存在腸道微生態(tài)的差異。通過代謝組學檢測兩組血漿代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩組間血漿代謝產(chǎn)物存在明顯差異，尤其是8種補陽還五湯代謝產(chǎn)物血漿中濃度兩組間存在明顯差異，其中缺血中風氣虛血瘀證大鼠中甜菜堿、α-紫羅蘭酮、甲基沒食子酸-O-硫酸鹽、阿拉伯糖、棕櫚酸、紫花前胡醇顯著上調(diào)，阿糖腺苷、3-O-甲基沒食子酸顯著下調(diào)，并經(jīng)相關性分析發(fā)現(xiàn)其中7種與屬分類水平腸道菌群存在著顯著的相關性。已有的研究證實，缺血中風氣虛血瘀證大鼠組上調(diào)的甜菜堿（POS972）在多種疾病中具有抗炎作用，可以改善硫氨基酸代謝與氧化應激，抑制Nuclear factor-κB活動和NLRP3 inflammasome的激活，調(diào)節(jié)能量代謝，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡[18];當歸中的有效成分紫花前胡醇（NEG3499）則通過調(diào)節(jié)生長因子等顯示出潛在的抗炎活性[19];而下調(diào)的甲基沒食子酸則有促氧化作用，導致DNA損傷，增加細胞內(nèi)活性氧的水平，誘導神經(jīng)元細胞的細胞毒性[20]。

本文實驗結(jié)果提示，缺血中風氣虛血瘀證大鼠腸道菌群差異導致補陽還五湯在腸道的吸收存在差異，部分具有抗炎、抗氧化應激作用的藥物成分表達吸收增加，而具有促炎作用的物質(zhì)表達吸收減少，從而可能更好地起到腦保護作用，這種差異可能是其辨證用藥的基礎。但由于運用UPLC-MS的非靶向代謝組學的方法鑒定的化合物分子量較小（<1 000 Da），且質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫不全，大部分代謝物無法定性，導致很多補陽還五湯相關代謝產(chǎn)物無法鑒定而遺漏，還有待進一步研究。

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