鐘森杰 李靜 黃淑敏 楊夢 邱宏 程彬 胡志希 李琳

〔摘要〕 目的 研究慢性心衰心氣陰虛證大鼠的糞便代謝組學(xué)特征。方法 13只Dahl鹽敏感大鼠隨機(jī)分為空白對照組（6只）和模型組（7只），以高鹽飼料（8%NaCl）飼養(yǎng)模型組大鼠20周復(fù)制心衰模型。成模后采集兩組大鼠的糞便樣本，運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)分析其代謝成分。結(jié)果 主成分分析和偏最小二乘判別分析得到的得分圖顯示，兩組的代謝成分積分點(diǎn)完全分離，表明兩組大鼠的代謝模式存在明顯差異。與空白對照組比較，模型組神經(jīng)氨酸、尿苷、丙氨酰色氨酸、酪氨酰纈氨酸、苯丙氨酰甘氨酸、?；敲撗跄懰?、糞甾烷酸、白三烯E4的水平上調(diào)，谷氨酸、酪氨酸、煙酸、鞘氨醇、二十四烷酸、二十二碳六烯酸、亞油酸的水平下調(diào)。15種差異代謝產(chǎn)物參與了19條代謝通路，其中氮代謝通路和氨酰tRNA的生物合成通路富集性較顯著。結(jié)論 慢性心衰心氣陰虛證大鼠的代謝功能異常，其病理機(jī)制涉及氨基酸代謝紊亂、蛋白質(zhì)代謝紊亂、脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、腸道功能失衡等多個層面。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性心衰;心氣陰虛證;代謝組學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5;R541.6+;969.1 ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.004

〔Abstract〕 Objective To study the fecal metabolomic characteristics of rats with heart-Qi Yin deficiency syndrome of chronic heart failure. Methods Thirteen Dahl salt-sensitive rats were divided into a blank control group （6 rats） and a model group （7 rats）. Rats in the model group were fed with high salt diet （8% NaCl） for 20 weeks to replicate the heart failure model. After modeling， fecal samples from the 2 groups of rats were collected， and their metabolic components were analyzed using ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS） combined technology and multivariate statistical analysis. Results The score chart obtained by principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis showed that the integral point of metabolic components was completely separated between the 2 groups， indicating that there was a significant difference in metabolic pattern between the 2 groups. Compared with the blank control group， the levels of neuraminic acid， uridine， alanyl tryptophan， tyrosinyl valine， phenylalanyl glycine， taurodeoxycholic acid， coprocholic acid and leukotriene E4 in the model group were up-regulated. The levels of glutamic acid， tyrosine， nicotinic acid， sphingosine， tetracarboxylic acid，docosahexaenoic acid and linoleic acid were down-regulated. 15 different metabolites participated in 19 metabolic pathways. Nitrogen metabolism pathway and aminoacyl-tRNA biosynthesis pathway had more significant enrichment. Conclusion Metabolic function of rats with heart-Qi Yin deficiency syndrome of chronic heart failure was disturbed. Its pathological mechanism involves amino acid metabolism disorder， protein metabolism disorder， lipid metabolism disorder， inflammatory reaction， intestinal dysfunction and other aspects.

〔Keywords〕 chronic heart failure; heart-Qi Yin deficiency syndrome; metabolomics

前期研究基于“以方測證”法及一般行為觀察，驗(yàn)證高血壓心衰大鼠模型屬心氣陰虛證，構(gòu)建了可靠的病證結(jié)合動物模型，并從血漿代謝組學(xué)角度對該模型的生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行初探[1-3]。隨著生物信息學(xué)研究的深入，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物與高血壓病、慢性心衰等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[4]。本研究運(yùn)用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)觀察糞便中代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝途徑的變化，以期多層次、多角度闡釋該病證模型的病理機(jī)制及生物學(xué)基礎(chǔ)，為今后開展心衰的靶向代謝組學(xué)及腸道菌群研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物與分組

6周齡Dahl鹽敏感大鼠13只，體質(zhì)量（230±10） g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號：43004700037714，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。所有大鼠予常規(guī)飼料（0.3%NaCl濃度）適應(yīng)性培育至7周齡，以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組（6只）和模型組（7只）。

1.2 ?主要儀器與試劑

主要儀器：JXFSTPRP-24/32型研磨器（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;TGL-16MS型臺式冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀儀器有限公司）;ACQUITY UPLC型高效液相色譜儀、Xevo G2-XS QTof型質(zhì)譜儀（Waters科技有限公司）;BP-2010A型實(shí)驗(yàn)動物血壓計(jì)（北京Softron有限公司）;SB-5200DT型超聲清洗器（寧波新芝科技有限公司）;SonoScape-S2N型實(shí)驗(yàn)動物超聲儀（深圳開立科技有限公司）。

主要試劑：L-2-氯苯丙氨酸（上海恒創(chuàng)生物科技公司）;甲醇、甲酸、乙腈（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司）;所有試劑皆為分析純、色譜級。

1.3 ?模型制備

模型的制備與驗(yàn)證均依據(jù)本課題組的前期研究結(jié)果[1-2]?？瞻讓φ战M予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，模型組予高鹽（8%NaCl）飼料飼養(yǎng)，每只每天20 g飼料，自由取水，共飼養(yǎng)20周。每日觀察一般行為及體征情況，每兩周檢測1次鼠尾血壓，飼養(yǎng)20周后行心臟超聲檢測和血清氨基末端腦鈉肽前體（N-Terminal-pro brain natriuretic peptide， NT-proBNP）含量測量，以評價(jià)模型是否建立成功。

1.4 ?糞便樣本預(yù)處理

模型建立成功后，收集所有大鼠的糞便樣本，進(jìn)行上機(jī)前的預(yù)處理：（1）60 mg糞樣中添加20 μL的L-2-氯苯丙氨酸（0.3 mg/mL）和600 μL的甲醇∶水（V∶V=4∶1）;（2）添加兩顆鋼珠，-20 ℃預(yù)冷2 min，研磨機(jī)60 Hz條件下研磨2 min;（3）超聲提取10 min，低溫條件下放置30 min;（4）離心10 min（12 000 r/min、4 ℃），取200 μL上清液，過濾后裝瓶，保存于-80 ℃冰箱中，待上機(jī)檢測用。

1.5 ?UPLC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫45 ℃;流動相：A-水、B-乙腈，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：選用ESI離子源，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行信號采集;Capillary voltages設(shè)置：正離子3 kv，負(fù)離子-2 kv。

1.6 ?數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Progenesis QI v2.3軟件處理上機(jī)檢測后得到的原始數(shù)據(jù)，主要進(jìn)行基線過濾、保留時(shí)間校正、峰對齊和峰識別。將正、負(fù)離子數(shù)據(jù)合并成一個數(shù)據(jù)矩陣，矩陣包含了原始數(shù)據(jù)提取到的所有可以用于后續(xù)分析的信息?；诰_質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，選用Human Metabolome Database數(shù)據(jù)庫和Metlin數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物的定性定量分析。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SIMCA14.0軟件分析數(shù)據(jù)矩陣，先進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（PCA），隨后進(jìn)行有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（PLS-DA），生成得分圖。差異代謝物篩選基于正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），以變量權(quán)重值VIP>1.0視為對分類具有較大貢獻(xiàn)的變量，進(jìn)一步行t檢驗(yàn)和Log2（FC）分析，以P<0.05且FC>2.0為最終納入條件。運(yùn)用MetaboAnalyst網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行差異代謝物的通路拓?fù)浞治?，篩選出與模型相關(guān)的顯著通路。

2 結(jié)果

2.1 ?模型評價(jià)

自高鹽飲食后，模型組大鼠的收縮壓一直維持在140 mmHg上，飼養(yǎng)4周后基本保持在160 mmHg以上，符合高血壓病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可構(gòu)成心臟器質(zhì)性損傷;空白對照組大鼠的收縮壓始終未超過140 mmHg，難以構(gòu)成靶器官心臟的損傷，可作為空白對照。飼養(yǎng)結(jié)束后，模型組左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左室短軸縮短率（fraction shortening， FS）顯著低于空白對照組（P<0.01），NT-proBNP值顯著高于空白對照組（P<0.01），確定已成慢性心衰模型，見表1。

造模結(jié)束后，模型組大鼠均出現(xiàn)心率增快、精神萎靡、呼吸急促、蜷縮喜臥、易激怒等體征及行為表現(xiàn)，較好地表現(xiàn)出心悸、氣短、乏力、煩躁等心氣陰虛證的證候特點(diǎn)，符合本課題組前期“以方測證”研究的結(jié)果，認(rèn)為已成心氣陰虛證動物模型[1-3]。

2.2 ?總離子流圖

UPLC-MS分析后，獲得兩組大鼠正負(fù)離子模式下的代表性總離子流圖（total ion chromatography， TIC），具體見圖1。

2.3 ?模式判別分析

PCA可從總體角度反映樣本組間和組內(nèi)的變異度，從PCA得分圖中可直觀地看出兩組樣本之間的整體代謝輪廓差異;PLS-DA運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣本分組之間的關(guān)系模型，以預(yù)測樣本類別，解釋組間差異。從兩組大鼠的PCA得分圖、PLS-DA得分圖（圖2）可看出，兩組的樣本點(diǎn)在分布上完全分開，組內(nèi)的聚集效果良好，組間的分離趨勢顯著，預(yù)測模型的擬合能力較好。表明慢性心衰心氣陰虛證大鼠的代謝功能被明顯擾動，與正常大鼠間存在顯著的代謝表型差異。

2.4 ?差異代謝物篩選

OPLS-DA模型下的變量權(quán)重值（VIP）可以說明某一變量對造成分組的貢獻(xiàn);Log2（FC）值說明代謝物在兩組樣本中平均表達(dá)量的比值。本次研究對篩選VIP>1.0的慢性心衰心氣陰虛證大鼠代謝物進(jìn)行t檢驗(yàn)及FC分析，以P<0.05且FC>2.0為條件，共挖掘出組間差異代謝物15種，具體見表2。與空白對照組比較，模型組神經(jīng)氨酸、尿苷、丙氨酰色氨酸、酪氨酰纈氨酸、苯丙氨酰甘氨酸、?；敲撗跄懰?、糞甾烷酸、白三烯E4的水平上調(diào)，谷氨酸、酪氨酸、煙酸、鞘氨醇、二十四烷酸、二十二碳六烯酸、亞油酸的水平下調(diào)。

2.5 ?代謝路徑分析

為進(jìn)一步解讀代謝圖譜，選用MetaboAnalyst網(wǎng)絡(luò)軟件（https：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行差異代謝物的路徑拓?fù)浞治觥７治霭l(fā)現(xiàn)，與模型大鼠相關(guān)的15種差異代謝產(chǎn)物共參與19條代謝通路，繪制了通路分析概要圖，以全局性的角度觀察模型的生物學(xué)變化，見圖3。其中2條通路富集性較顯著，分別為氮代謝通路（nitrogen metabolism）和氨酰tRNA的生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）。

3 討論

在心衰的病理過程中，心臟的功能與結(jié)構(gòu)持續(xù)受損，機(jī)體供能不足，這必然會引起體內(nèi)部分功能的失衡。前期研究以血液代謝產(chǎn)物為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)慢性心衰心氣陰虛證模型的內(nèi)源性代謝功能被明顯擾動，存在三大代謝途徑（氨基酸、糖類、脂類）紊亂和肝功能損傷[3]。糞便代謝物是腸道微生物和宿主共代謝的結(jié)果，許多研究證據(jù)表明：腸道微生物及其代謝產(chǎn)物與心衰間有著廣泛關(guān)聯(lián)，這為開展心衰模型的糞便代謝組學(xué)研究提供了依據(jù)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性心衰心氣陰虛證模型大鼠的糞便代謝輪廓出現(xiàn)變化，篩選出與該模型相關(guān)的15種代謝物和2條代謝路徑，對上述關(guān)鍵信息進(jìn)行分析，以進(jìn)一步闡明該病證的微觀本質(zhì)。

在已篩選的差異代謝物中，氨基酸及其合成的多肽類物質(zhì)占比最重。心衰的病理過程中伴隨著心臟產(chǎn)能的底物利用改變，即糖、脂氧化供能向氨基酸供能轉(zhuǎn)化，氨基酸代謝增強(qiáng)以滿足機(jī)體的能量需求，故可見氨基酸類物質(zhì)谷氨酸、酪氨酸的水平紊亂。谷氨酸、酪氨酸參與了氨酰tRNA的生物合成，氨酰tRNA的主要作用為轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[6]。氨基酸和氨酰tRNA出現(xiàn)改變，直接影響了蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)心衰時(shí)的各種損傷因素均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)代謝的異常，主要體現(xiàn)在丙氨酰色氨酸、酪氨酰纈氨酸和苯丙氨酰甘氨酸等蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物呈高水平表達(dá)狀態(tài)。

鞘氨醇屬鞘脂類化合物，參與細(xì)胞的生長、分化、衰老和程序性死亡等重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分[7]。長期高鹽飲食會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷血管構(gòu)架與功能，推動高血壓病、心衰等心血管疾病的發(fā)展進(jìn)程。炎癥反應(yīng)可擾動細(xì)胞膜，影響鞘脂類代謝通路，同時(shí)產(chǎn)生白三烯E4等炎癥介質(zhì)類化合物[8]。另有研究表明，氮代謝通路異?？缮险{(diào)部分細(xì)胞因子及生物活性物質(zhì)的表達(dá)，與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[9]。鞘氨醇、白三烯E4水平紊亂及氮代謝通路異常，驗(yàn)證了炎癥反應(yīng)是該病證模型的病理機(jī)制之一。

脂類代謝方面，二十二碳六烯酸和亞油酸均屬于多不飽和脂肪酸，二十二碳六烯酸具有促進(jìn)膽固醇排泄、抑制內(nèi)源性膽固醇合成的作用;亞油酸能與膽固醇結(jié)合，防止膽固醇淤積于血管壁，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)堆積[10]。不飽和脂肪酸在脂質(zhì)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，其水平紊亂是導(dǎo)致體內(nèi)脂類代謝障礙的關(guān)鍵原因之一。二十四烷酸是一種長鏈脂肪酸，多呈游離狀態(tài)存在，有異于大部分脂肪酸，但目前針對該物質(zhì)的研究較少，其變化機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

?；敲撗跄懰釋俳Y(jié)合膽汁酸，由游離膽汁酸以酰胺鍵與?；撬嵯嘟Y(jié)合而生成;糞甾烷酸屬三羥基膽汁酸。前期研究已證實(shí)該模型存在膽固醇代謝障礙，膽固醇直接參與膽汁酸的合成，其代謝障礙必然影響膽汁酸代謝，故可見?；敲撗跄懰岷图S甾烷酸水平紊亂[11]。另一方面，膽汁酸主要存在于腸-肝循環(huán)系統(tǒng)中，可在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪，調(diào)節(jié)脂類代謝，從膽汁酸代謝障礙推測出該模型可能存在腸道功能的失衡[12]。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)的二十二碳六烯酸、亞油酸和煙酸等物質(zhì)，主要來源于腸道對食物的攝取，生物體內(nèi)的自身生成量甚少，上述物質(zhì)的水平紊亂也在一定程度上反映了模型的腸道功能失衡。

綜合分析慢性心衰心氣陰虛證模型大鼠的糞便代謝圖譜，發(fā)現(xiàn)該病證模型的病理機(jī)制涉及氨基酸、蛋白質(zhì)、脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)、腸道功能失衡等多個層面。本研究進(jìn)一步揭示了與該病證模型相關(guān)的生物學(xué)信息，以期為心衰的診療提供新思路，并為今后開展心衰模型的靶向代謝組學(xué)和腸道菌群研究提供借鑒。

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