張 磊

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，隨著人類生活條件的改善，良好飲食習(xí)慣的建立以及幽門螺桿菌的根除，胃癌的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)。然而，全球胃癌的發(fā)病率及病死率仍居高不下[1]。隨著分子病理學(xué)的發(fā)展，對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的了解有了長足的進(jìn)步，但離最終闡明仍相去甚遠(yuǎn)。因此，有必要進(jìn)一步探索并尋找胃癌新型治療靶標(biāo)，以達(dá)到抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移，提高患者生存率的目的。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和向遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移[2]。在此過程中，細(xì)胞經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)上的變化，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞連接和極性并轉(zhuǎn)化為具有侵襲與轉(zhuǎn)移特性的間充質(zhì)細(xì)胞[3]。越來越多的證據(jù)表明EMT可引發(fā)細(xì)胞遷移/侵襲并導(dǎo)致癌細(xì)胞的耐藥性[4-5]。本實(shí)驗(yàn)在組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)水平上探討Twist基因?qū)ξ赴┘?xì)胞EMT的意義。

1 材料與方法

1.1 材料小量及中量質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物公司；內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；DNA Marker、瓊脂糖購自美國Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司；Twist RNAi表達(dá)載體、引物設(shè)計(jì)與合成購自上海生工生物公司；轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；96孔板及Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自Millipore公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株BGC-823購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，-80 ℃冰箱中保存。細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，細(xì)胞匯合度70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Twist小干擾RNA(siRNA)的構(gòu)建 根據(jù)Genbank中Twist基因(585 bp，NM 000474)的核苷酸序列及siRNA設(shè)計(jì)原則，針對(duì)Twist cDNA編碼區(qū)第861～881位核苷酸進(jìn)行干擾片段的設(shè)計(jì)，寡核苷酸兩端分別帶有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，合成序列如下：正義鏈5′-GATCCGATG GCAAGCTGCAGCTATTTCAAGAGAATAGCTGCAGCTTGCCAT CTTTTTTGGAA-3′，反義鏈5′-AGCTTTTGCAAAAAAGATG GCAAGCTGCAGCTATTCTCTTGAAATAGCTGCAGCTTGCCAT CG-3′。連接Psilencer 3.1質(zhì)粒，化入大腸桿菌DH5a中。將連接產(chǎn)物各取4 μL分別接種于100 μL的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提。用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ分別對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定。將鑒定后的Twist siRNA重組質(zhì)粒送上海生工生物公司進(jìn)行測序。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將鑒定成功的Twist小干擾RNA作為干擾組，未轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.3總RNA提取 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，胰酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min。棄上清，每(5～10)×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL Trizol試劑后，反復(fù)用槍吹打，冰上裂解細(xì)胞。將Trizol裂解液轉(zhuǎn)入無酶EP管中，室溫靜置5 min。按每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，用力震蕩15 s，室溫下放置5 min，12 000g，2～8 ℃離心15 min。吸取上層水相置于新的無酶EP管中，按每1 mL Trizol加500 μL異丙醇的量加入異丙醇，室溫下放置10 min，12 000g，2～8 ℃離心10 min。棄上清，加1 mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7 500g，2～8 ℃離心5 min。棄上清，干燥沉淀的RNA。加入15～20 μL的DEPC水溶解RNA沉淀，-80 ℃冰箱中保存。操作過程均在冰上進(jìn)行，以防止RNA降解。核酸檢測儀測定RNA的濃度及吸光度OD260/280。

1.2.4qRT-PCR反應(yīng) 提取BGC-823細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)美國Fermentas公司熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行冰上加樣，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：10×buffer 2.5 μL、dNTP混合液0.5 μL、cDNA 2.0 μL；上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.3 μL、去離子水18.7 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 40 s退火，72℃ 40 s延伸，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，基因表達(dá)產(chǎn)物以2-ΔΔCt計(jì)算。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所需引物序列包括：Twist上游引物5′-GCTCAGCTACGCCTTCTCG-3′，下游引物5′-GATGCCTTTC CTTTCAGTG-3′；E-cadherin上游引物5′-ATCCAAAGCCTCA GGTCATAAACA-3′，下游引物5′-AAGAAACAGCAAGAGCAG CAGAAT-3′；N-cadherin上游引物5′-CCATCAAGCCTGTGG GAATC-3′，下游引物5′-CCCCAGTCGTTCAGGTAATCAT-3′；GAPDH上游引物5′-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為每毫升1.5×105個(gè)細(xì)胞，分別對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行處理，37 ℃下孵育過夜。在80%～90%濃度下，用10 μL槍頭劃出一致的劃痕傷口，用PBS洗滌細(xì)胞2次，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后通過計(jì)算劃痕面積得出細(xì)胞遷移率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn) 對(duì)Matrigel進(jìn)行1∶8稀釋，覆蓋在Transwell小室的上室面，37 ℃ 30 min聚集成凝膠。實(shí)驗(yàn)前一天細(xì)胞饑餓12～24 h。消化細(xì)胞，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1～2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度每毫升5×105個(gè)細(xì)胞。向下室加入600 μL含30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取1 00 μL細(xì)胞懸液加入上室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。取出小室，用棉簽輕輕刮除上室未穿過的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定20 min后染色。在200倍光鏡下計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)，每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。以穿透的細(xì)胞數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.7Western blot檢測 消化收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入99 μL RIPA裂解液與1 μL PMSF制備細(xì)胞裂解物，BCA法測定蛋白濃度。取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。條帶置于含5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液中封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。加入二抗37 ℃孵育2 h后，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，Image J v1.8.0測定相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.2.8臨床病理組織標(biāo)本 根據(jù)赫爾辛基宣言，收集25例臨床胃癌組織和相鄰的癌旁正常組織(患者術(shù)前均未接受過放、化療)均來自皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院(六安市第二人民醫(yī)院)，標(biāo)本置于-80 ℃液氮中保存。

1.2.9Kaplan-Meier數(shù)據(jù)分析 在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析平臺(tái)中檢索Twist基因，限定條件為總生存和無疾病進(jìn)展生存，并在線繪制Twist表達(dá)的生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 Twist對(duì)胃癌組織的影響通過qRT-PCR技術(shù)檢測25例胃癌組織標(biāo)本結(jié)果顯示，相對(duì)于癌旁組織，Twist在癌組織中表達(dá)上升(P<0.05)，且通過Kaplan-Meier Plotter軟件分析得到Twist基因高表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說明Twist在胃癌中發(fā)揮癌基因作用，且表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差(圖1)。

圖1 Twist在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系：A.癌與癌旁組織中Twist表達(dá)情況；B.生物信息軟件預(yù)測Twist基因表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系

2.2 干擾Twist基因?qū)?xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)檢測干擾Twist對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，干擾組細(xì)胞遷移率減低(P<0.05)。提示干擾Twist表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力明顯降低(圖2)。

2.3 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力改變采用Transwell小室檢測各組細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于對(duì)照組，干擾組細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示干擾Twist表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力明顯降低(圖3)。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力改變

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力改變

2.4 干擾Twist基因EMT相關(guān)因子的表達(dá)采用qRT-PCR及Western blot法檢測各組中EMT相關(guān)因子E-cadherin及N-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，與對(duì)照組相比，干擾Twist表達(dá)后，E-cadherin的相對(duì)表達(dá)量增高(P<0.01)，而N-cadherin的表達(dá)量降低(P<0.05，圖4)。

圖4 qRT-PCR檢測EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：A.qRT-PCR檢測E-cadherin mRNA的表達(dá)；B.Western blot檢測E-cadherin蛋白的表達(dá)；C.qRT-PCR檢測N-cadherin mRNA的表達(dá)；D.Western blot檢測N-cadherin蛋白的表達(dá)；*P<0.05；**P<0.01

3 討論

胃癌是消化道較常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)環(huán)節(jié)、多個(gè)步驟[6-7]。以往胃癌的好發(fā)年齡在50歲以上，且男性的發(fā)病率高于女性，但隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、感染等因素的改變，胃癌的發(fā)生趨于年輕化。近年腫瘤靶向治療成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)，也為胃癌的診斷、治療及預(yù)后提供了新的方向[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Twist基因參與胃癌BGC-823細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，推測其可能是胃癌細(xì)胞的新型靶向生物標(biāo)志物，但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲能力及遷移游走的特性[9]。研究表明miR-33a通過Snail/Slug信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[10]。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)Twist基因參與形成胃癌細(xì)胞的EMT，抑制其在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)有助于逆轉(zhuǎn)EMT，但關(guān)于逆轉(zhuǎn)EMT的具體機(jī)制需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

Twist被認(rèn)為是EMT過程中的關(guān)鍵因子之一。MEST通過STAT3激活導(dǎo)致Twist-1誘導(dǎo)，且通過誘導(dǎo)STAT3核轉(zhuǎn)位能夠誘導(dǎo)EMT程序的激活[11]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)Twist-1是miR-335的直接靶點(diǎn)且沉默Twist-1基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)了miR-335抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞活力增加、遷移、侵襲和EMT相關(guān)蛋白的異常表達(dá)。此外，國內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道Twist-1參與形成胃癌細(xì)胞EMT。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾Twist基因表達(dá)后，EMT相關(guān)因子E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，而N-cadherin表達(dá)明顯下降，說明Twist基因在促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823的EMT過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，干擾Twist表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)位置在干擾前后并無明顯改變，因此推測在胃癌EMT過程中可能需要其他細(xì)胞因子或通道蛋白與Twist共同發(fā)揮作用，至于可能存在的調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的其他關(guān)鍵蛋白或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑則有待于進(jìn)一步研究分析。