楚剛輝, 姜盼盼

(喀什大學(xué) 新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 新疆 喀什 844006)

雪菊是新疆和田、 喀什等地區(qū)的一種特色花茶, 具有降血壓、 降血糖、 降血脂和抗氧化等功效[1-6], 在新疆多地區(qū)已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化種植[7]. 黃酮和其他多酚類物質(zhì)是雪菊的主要有效成分[8-9], 木犀草苷是雪菊中的一種黃酮類物質(zhì), 由木犀草素結(jié)合一個(gè)單糖組成. 木犀草苷的鄰二酚羥基特殊結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化、 抗腫瘤、 抗感染和解熱抗炎等藥理活性[10]. 目前, 植物中木犀草苷的常見分析方法有高效液相色譜法[11-12]、 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]、 二維液相色譜法[15]和超臨界色譜法[16]等, 這些方法具有良好的選擇性, 但操作繁瑣、 有機(jī)溶劑消耗多且測(cè)定時(shí)間長(zhǎng). 近紅外光譜(NIR)是介于可見與中紅外光間的一種電磁輻射光譜, 主要反映有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(O—H,N—H,C—H等)振動(dòng)的倍頻和合頻的吸收光譜信息. NIR分析測(cè)定技術(shù)具有無損、 快速、 易實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)勢(shì), 可用于農(nóng)業(yè)、 煙草和制藥等行業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制[17-18]. 近紅外光譜檢測(cè)限高, 可用于質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.1%的組分分析. 為實(shí)現(xiàn)近紅外光譜的靈敏性檢測(cè), 以富集技術(shù)與近紅外光譜結(jié)合進(jìn)行樣品中微量成分的檢測(cè)研究已引起人們廣泛關(guān)注[19-21], 如在一定條件下, 木犀草素的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可與某些金屬離子配合[22-23]. 木犀草苷是木犀草素結(jié)合一個(gè)單糖的糖苷類物質(zhì)， 也可通過其鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)與金屬的配合作用富集樣品中的木犀草苷. 本文以新疆巴楚產(chǎn)的雪菊為測(cè)試樣品, 用制備的銅摻雜二氧化硅作為吸附劑對(duì)雪菊所含的微量木犀草苷進(jìn)行富集, 并通過近紅外漫反射光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)微量木犀草苷靈敏、 選擇性地檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

AntarisⅡ型近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)； 電子天平(美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司)； 電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)； 超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)； TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)； SF-TDL-2SOA型低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)； HY-2型多用調(diào)速振蕩器, JJ-2型增力電動(dòng)攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠).

正硅酸乙酯(體積分?jǐn)?shù)為98%)， 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES, 體積分?jǐn)?shù)為98%)， 木犀草苷(上海晶純生化科技股份有限公司, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)； 乙醇、 CuSO4和NaOH均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?新疆巴楚產(chǎn)的雪菊, 粉碎機(jī)粉碎, 備用.

1.2 方 法

1.2.1 銅摻雜二氧化硅吸附劑的制備 參照同步水解方法[24]制備吸附劑： 將100 mL乙醇加入500 mL三頸燒瓶中, 置于35 ℃水浴中加熱, 先加入4.0 mL的APTES, 并將100 mL的2 mol/L CuSO4水溶液和20 mL的正硅酸乙酯攪拌1 h, 再加入w(NaOH)=1%的水溶液20 mL, 滴加結(jié)束后, 繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h. 在反應(yīng)過程中溶液逐漸變藍(lán), 形成藍(lán)色乳狀液. 最后, 通過離心分離收集產(chǎn)物, 先用純凈水洗滌至中性, 再用無水乙醇洗滌一次, 收集產(chǎn)物自然晾干后研細(xì), 備用. 銅摻雜二氧化硅吸附劑合成機(jī)理如圖1所示.

圖1 銅摻雜二氧化硅吸附劑合成機(jī)理

1.2.2 木犀草苷吸附實(shí)驗(yàn) 用銅摻雜二氧化硅吸附劑對(duì)木犀草苷進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn). 在100 mL錐形瓶中先加入0.25 g吸附劑, 再加入50 mL一定質(zhì)量濃度的木犀草苷或雪菊提取溶液, 在室溫下于振蕩器中振蕩30 min后, 用量筒式過濾器過濾, 在349 nm處測(cè)定濾液吸光度. 木犀草苷的吸附率計(jì)算公式為

吸附率=[(A0-A)/A0]×100%,

其中,A0和A分別為木犀草苷溶液吸附前后的吸光度.

1.2.3 木犀草苷的HPLC分析方法 用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定雪菊提取液中木犀草苷的含量, 以方便精確配制系列雪菊測(cè)試溶液. 色譜條件： Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱, 以乙腈(A)和φ(醋酸)=0.2溶液(B)為流動(dòng)相, 用梯度洗脫的方式： 0 (φ(A)=15%), 0～40 min(φ(A)=15%～90%) ； 流速為1 mL/min； 色譜柱為常溫, 進(jìn)樣10.0 μL； 檢測(cè)波長(zhǎng)為349 nm. 配制質(zhì)量濃度為1.0～300.0 mg/L的木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)樣品系列, 分別進(jìn)樣10.0 μL, 進(jìn)行色譜分析. 以木犀草苷的色譜峰面積為縱坐標(biāo)、 質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)獲得一元線性回歸方程：

y=84 016x-2×106,R2=0.994 7.

雪菊提取溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后, 注入色譜儀分析. 圖2為雪菊提取液和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜.

圖2 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)樣品(A)和雪菊提取液(B)的色譜

1.2.4 雪菊提取液的制備與木犀草苷的富集 稱取適量雪菊, 分別置于100 mL錐形瓶中, 加入φ(甲醇)=35%水溶液50 mL, 靜置過夜后, 超聲30 min, 過濾后備用. 按雪菊樣品高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果, 制成一系列質(zhì)量濃度為1.5～19.5 mg/L的雪菊提取液, 共68組. 稱取0.25 g一系列銅摻雜二氧化硅吸附劑, 分別置于100 mL錐形瓶中, 再分別加入68組雪菊提取液, 每組均為50 mL. 在常溫下振蕩吸附30 min, 抽濾, 將濾渣于陰涼處自然晾干. 根據(jù)木犀草苷吸附劑不需脫附目標(biāo)物的性質(zhì), 用近紅外光譜直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)定, 獲得68個(gè)雪菊固體樣品的近紅外光譜, 其中以16個(gè)雪菊樣本(5對(duì)重復(fù)樣)為預(yù)測(cè)模型, 進(jìn)行近紅外光譜分析.

圖3 68個(gè)木犀草苷樣品的近紅外光譜

1.2.5 光譜測(cè)量方法 用近紅外光譜儀測(cè)定68個(gè)雪菊固體樣品光譜, 儀器分辨率為4 cm-1, 在4 000～10 000 cm-1近紅外光范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描, 測(cè)試前儀器預(yù)熱1 h, 儀器測(cè)試過程中, 每運(yùn)行1 h自動(dòng)實(shí)現(xiàn)校正背景. 為提高雪菊固體樣品的測(cè)定信噪比并降低誤差, 每次測(cè)量均進(jìn)行64次掃描, 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次, 將3次數(shù)據(jù)的平均值作為光譜數(shù)據(jù). 68個(gè)雪菊固體樣品的近紅外疊加光譜如圖3所示. 近紅外光譜自身靈敏度較低, 可通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法與偏最小二乘回歸共同實(shí)現(xiàn)定量模型的建立和含量預(yù)測(cè), 通過儀器軟件包TQ analyst 9和MATLAB程序?qū)崿F(xiàn)建模和預(yù)測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 銅摻雜二氧化硅的紅外光譜

圖4 氨基二氧化硅和銅摻雜二氧化硅的紅外光譜

分別將氨基二氧化硅和銅摻雜二氧化硅與溴化鉀按質(zhì)量比為1∶100～1∶200壓片, 在500～4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描, 結(jié)果如圖4所示. 由圖4可見, 在3 414 cm-1處為氨基的伸縮振動(dòng)峰, 在1 632,1 541 cm-1處為氨基的彎曲振動(dòng)峰, 在1 400 cm-1處為亞甲基的彎曲振動(dòng)峰. 銅摻雜二氧化硅的紅外光譜在3 414 cm-1處的吸收峰消失, 這是由于氨基和銅發(fā)生了配合作用所致； 氨基的兩個(gè)彎曲振動(dòng)峰遷移至1 623,1 512 cm-1處, 這是由于生成銅氨基配合物后形成環(huán)狀結(jié)構(gòu), 使共軛體系增強(qiáng), 吸收峰向低波數(shù)區(qū)遷移所致.

2.2 銅摻雜二氧化硅的掃描電鏡照片

用掃描電鏡(SEM)檢測(cè)銅摻雜二氧化硅顆粒的表面形態(tài), 圖5(A)和(B)分別為放大2 000,10 000倍的掃描電鏡照片. 由圖5(A)可見, 其表面粗糙, 表明材料表面已結(jié)合了硅烷化產(chǎn)物； 由圖5(B)可見, 材料表面有豐富的孔隙, 可供目標(biāo)物吸附結(jié)合.

圖5 銅摻雜二氧化硅的SEM照片

2.3 銅摻雜二氧化硅吸附劑對(duì)木犀草苷的吸附

圖6 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)液吸附前后的紫外可見光譜

為考察目標(biāo)組分木犀草苷在銅摻雜二氧化硅吸附劑上的吸附行為, 準(zhǔn)確稱取0.25 g銅摻雜二氧化硅吸附材料, 置于100 mL錐形瓶中, 加入8.0 mg/L木犀草苷水溶液50 mL, 密塞. 于振蕩器中振蕩30 min, 量筒式過濾分離, 測(cè)量吸附前后木犀草苷溶液的紫外可見光譜, 結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見： 木犀草苷的特征吸收波長(zhǎng)為349 nm； 與8.0 mg/L的木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜相比, 被銅摻雜二氧化硅吸附材料吸附后的吸收光譜在349 nm處的吸光度明顯減少, 吸附率達(dá)89.7%, 可見銅摻雜二氧化硅吸附劑對(duì)木犀草苷具有良好的吸附作用. 因此， 推測(cè)可能的吸附機(jī)理為銅離子與木犀草苷配合[22-23], 吸附機(jī)理如圖7所示.

2.4 木犀草苷的近紅外光譜

2.4.1 木犀草苷定量校正模型的建立 用偏最小二乘回歸(PLS)建立木犀草苷的定量模型, 為進(jìn)一步優(yōu)化該定量模型, 用一階導(dǎo)數(shù)(1st)、 多元散射校正(MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)和小波變換(CWT)等方法進(jìn)行原始近紅外光譜預(yù)處理[25-26]. 用Monte-Carlo交叉驗(yàn)證(MCCV)法獲得定量模型的因子數(shù), 不同光譜預(yù)處理獲得木犀草苷的定量模型和交叉驗(yàn)證結(jié)果列于表1.

圖7 木犀草苷的吸附機(jī)理

表1 木犀草苷的PLS定量模型及交叉驗(yàn)證結(jié)果

圖8 木犀草苷的預(yù)測(cè)質(zhì)量濃度與參考質(zhì)量濃度間的關(guān)系

由于近紅外光譜中包含目標(biāo)物木犀草苷的光譜信息及銅摻雜二氧化硅吸附材料與其他被吸附雜質(zhì)的組分信號(hào), 因此需選擇合適的光譜預(yù)處理方法， 以消除背景干擾對(duì)定量預(yù)測(cè)的影響. 用MATLAB程序建立各種光譜預(yù)處理和PLS定量模型, 木犀草苷定量模型的預(yù)測(cè)能力通過相關(guān)系數(shù)R、 交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)和預(yù)測(cè)殘差值(RPD)3個(gè)參數(shù)檢驗(yàn), 其中R反映木犀草苷預(yù)測(cè)的質(zhì)量濃度與真實(shí)質(zhì)量濃度的相關(guān)程度, RMSECV反映預(yù)測(cè)質(zhì)量濃度與真實(shí)質(zhì)量濃度間的偏離程度. 當(dāng)定量模型的RPD>2.5時(shí), 可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量預(yù)測(cè), RPD值越大, 其定量結(jié)果越準(zhǔn)確[27]. 對(duì)照無處理方法, 由表1可見： 經(jīng)1st,SG平滑,CWT,MSC,SNV,MSC+1st,SNV+1st處理后, RPD值變大, 表明光譜預(yù)處理可有效改善定量結(jié)果； MSC+1st處理后的相關(guān)系數(shù)R值最大, RMSECV誤差最小, RPD值最大, 表明該方法可有效提取木犀草苷的定量檢測(cè)信息, 且預(yù)測(cè)最準(zhǔn)確. 由于在樣品的近紅外漫反射測(cè)量模式中出現(xiàn)散射作用, 使原始光譜中含有大量與目標(biāo)組分吸收無關(guān)的干擾信息, 因此對(duì)定量模型的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響, MSC可將不同樣品光譜中的散射信息校正到同一水平, 從而提高了所得定量模型的可靠性[28], 1st可提高測(cè)定信噪比和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度[29], 由于MSC+1st發(fā)揮了二者的協(xié)同作用, 使預(yù)測(cè)結(jié)果最優(yōu). 因此, 本文用MSC+1st方法對(duì)雪菊固體樣品的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理.

2.4.2 木犀草苷的定量模型驗(yàn)證 為考察木犀草苷定量模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力, 用16個(gè)雪菊預(yù)測(cè)集樣品(5對(duì)重復(fù)樣)檢驗(yàn)建立的偏最小二乘定量模型. 校正集和預(yù)測(cè)集的光譜測(cè)量設(shè)備條件、 雪菊樣品制備方法及定量建模方法均相同, 結(jié)果如圖8所示, 其中校正集樣品的散點(diǎn)為黑色圈, 預(yù)測(cè)集樣品的散點(diǎn)為紅色圈, 參考質(zhì)量濃度以HPLC確定的結(jié)果為準(zhǔn). 由圖8可見, 二者相關(guān)關(guān)系良好. 當(dāng)模型的因子數(shù)為9時(shí), 測(cè)得校正集的相關(guān)系數(shù)為0.975 0, 預(yù)測(cè)RMSECV為0.959 8 mg/L, 木犀草苷預(yù)測(cè)集樣品的回收率為82.6%～111.4%. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 建立的木犀草苷定量校正模型對(duì)雪菊預(yù)測(cè)集樣品的預(yù)測(cè)效果良好, 在有吸附劑和吸附雜質(zhì)等背景干擾的情形下, 經(jīng)多元散射校正-一階導(dǎo)數(shù)(MSC+1st)法對(duì)雪菊樣品的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)先處理, 可從雪菊樣品的復(fù)雜光譜背景中獲取有效的定量檢測(cè)信息, 實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、 選擇性地測(cè)量雪菊提取液中木犀草苷的含量.

綜上所述, 本文以新疆巴楚產(chǎn)的雪菊為測(cè)試樣品, 用制備的銅摻雜二氧化硅作為吸附劑, 建立了一種雪菊中木犀草苷的富集和近紅外光譜檢測(cè)方法. 結(jié)果表明： 當(dāng)銅摻雜二氧化硅吸附劑用量為0.25 g、 常溫下振蕩吸附30 min時(shí), 對(duì)雪菊測(cè)試溶液中木犀草苷的吸附率達(dá)89.7%； 雪菊測(cè)試樣品的近紅外光譜經(jīng)MSC+1st處理后, 預(yù)測(cè)結(jié)果最好, 當(dāng)模型的因子數(shù)為9時(shí), 測(cè)得校正集的相關(guān)系數(shù)為0.975 0, 預(yù)測(cè)RMSECV為0.959 8 mg/L, 木犀草苷預(yù)測(cè)集樣品的回收率為82.6%～111.4%. 因此, 通過吸附與富集結(jié)合近紅外漫反射光譜可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、 選擇性地測(cè)量雪菊提取液中木犀草苷的含量.