陳 斌

(上海百雀羚日用化學有限公司第三分公司，上海 201400)

石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，性甘，微寒。歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。主治熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔等癥[2]。

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)在《中國藥典(2015年版)》中列為藥用石斛的首要來源[2]。原植物為石斛(Dendrobiumloddigesii，別名吊蘭花、扁金釵、小黃草、金釵石斛)、矩唇石斛(D.linawianum，別名金石斛)[3]?！敖疴O石斛”之名可能最早載于唐代《道藏》之《太上肘后玉經(jīng)方》[4-5]，《本草綱目》[6]正式將“金釵”作為石斛的別名而收載，并稱“其莖狀如金釵之股，故古有金釵石斛之稱”。

金釵石斛的化學成分主要有生物堿類、多糖類、黃酮類、酚類、香豆素類及甾體糖苷類化合物[7]。生物堿類成分是最早從石斛屬植物中分離并進行結構鑒定的化合物[8]。國內(nèi)外學者對金釵石斛中的生物堿類成分進行了大量的研究，已鑒定出的生物堿以石斛堿、石斛次堿等倍半萜類生物堿為主[9]。金釵石斛多糖類成分含量大約為4%[9]，Luo等[10]從金釵石斛粗多糖中分離出多個組分，主要包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和少量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖。此外，從金釵石斛中還分離得到13個酚酸類化合物、15個聯(lián)芐類化合物、8個菲類化合物和2個芴酮類成分[11-13]。

近年來，金釵石斛在化妝品中應用日益增多，主要集中在保濕、延緩衰老、美白等方面[7]。本研究旨在對以金釵石斛為主要成分的植物復方在化妝品中的應用情況進行研究，為其在化妝品中的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CM 825水分含量測試儀(Courage and khazaka，德國)；VC98皮膚測試儀(Visioscan)；T6新世紀型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Herocell 180 CO2培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司)；CellInsight CX5激光共聚焦顯微鏡(Thermo fisher scientific)；Varioskan LUX 多功能酶標儀(Thermo fisher scientific)；T100梯度PCR儀器(Bio-rad)；HH-4恒溫水浴鍋(常州容冠實驗分析儀器廠)；人表皮角質形成細胞(NHEK-C1809，上海冠導生物工程有限公司)；ABTS自由基清除能力檢測法使用試劑、MTT比色法使用試劑、乙醇、二甲基亞砜(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；Trizol(北京普利萊基因技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 金釵石斛提取液的制備

金釵石斛用25倍量的蒸餾水進行熱回流提取2次，溫度70℃，提取時間150 min，合并2次提取液，60℃旋轉蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到干粉為金釵石斛水提物。

1.2.2 保濕性能測試

選取12名的志愿者，分別以5%金釵石斛提取液(S1)、10%金釵石斛提取液(S2)、對照組為去離子水(CK)進行測試，取測試樣品5mL均勻涂抹于志愿者左右前臂屈側，在使用0、 1 、2、4 h后，分別使用水分含量測試儀對測試區(qū)域進行皮膚水分含量精密測試，皮膚水分含量值越大，說明皮膚含水量越高。與CK組進行對照分析，評價S1和S2的保濕效果。

測試結果中涉及的名詞定義及相關計算公式如下：

初始值：指未使用任何產(chǎn)品時的基礎值。

1.2.3 水通道蛋白3(AQP3)測試

(1)基于角質形成細胞的MTT檢測

金釵石斛提取液設置8個濃度梯度，每個濃度梯度設置8個重復，試驗設置溶劑對照孔和調(diào)零孔，采用MTT細胞活性檢測方法，篩選樣品在角質形成細胞中的最大安全劑量。

細胞接種：取對數(shù)生長期人表皮角質形成細胞消化后接種至96孔板。

樣品配制：精密稱取石斛水提物適量，分別配制成濃度為2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 mL/kg的樣品。

給藥：待細胞鋪板率達到40%時，開始給予樣品。

培養(yǎng)：給藥完成后，將培養(yǎng)板放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

檢測：細胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4 h后棄掉上清，每孔加150 μL二甲基亞砜，酶標儀490 nm讀取OD值。

細胞活性的計算方法見公式(1-1)：

(1-1)

(2)基于角質形成細胞的免疫熒光檢測

接種：以3×104個/孔的對數(shù)生長期人表皮角質形成細胞接種密度接種至含有蓋玻片的24孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。

配液：精密稱取石斛水提物適量配制成濃度500 mL/kg的樣品(根據(jù)MTT檢測試驗所得)。

給藥：待24孔板中細胞鋪板率達到30%時，開始給予樣品。

收樣：孵育培養(yǎng)結束后，棄掉培養(yǎng)液PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，4℃冰箱保存。

免疫熒光檢測：對細胞進行通透、封閉等操作后，AQP3抗體按照1∶500的工作濃度進行孵育，進行免疫熒光染色。

拍照：激光共聚焦顯微鏡40倍鏡下拍照。

1.2.4 絲聚蛋白(FLG)及緊密連接蛋白(CLDN-

1 mRNA)表達檢測

(1)基于角質形成細胞的MTT檢測

參考1.2.3(1)MTT檢測方法

(2)基于角質形成細胞的熒光定量PCR檢測

接種：以1.8×105個/孔的人表皮角質形成細胞接種密度接種6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。

配液：精密稱取石斛水提物適量配制成濃度500 mL/kg(根據(jù)MTT檢測試驗所得)。

給藥：待6孔板中細胞鋪板率達到40%時，開始給予樣品。

培養(yǎng)：給藥完成后，將培養(yǎng)板放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

收樣：孵育培養(yǎng)結束后，棄掉培養(yǎng)液每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解細胞后，收樣。

PCR 檢測：采用異硫氰酸胍裂解法，利用RNA提取試劑盒(T2654，北京華越洋生物科技有限公司)經(jīng)裂解、離心、上清吸附、孵育、洗脫、回收后提取獲得RNA，使用反轉錄試劑盒(WD3126，北京華越洋生物科技有限公司)配置反應體系，經(jīng)渦旋離心后在42℃孵育40 min，85℃孵育5 min，短暫離心后獲得cDNA，進行熒光定量PCR檢測。

1.2.5 皮膚表面活性分析方法

試驗分為兩組，試驗組添加S1；對照組為去CK。取測試樣品5 mL均勻涂抹于志愿者左右前臂屈側，等待4 h后使用皮膚測試儀測試受試者使用試驗組與對照組后肌膚鱗屑(角質脫落)情況。

1.2.6 抗氧化能力檢測

本試驗采用ABTS法測定金釵石斛提取液總抗氧化能力，其原理是：ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在732 nm或405 nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。

(1)準備評價金釵石斛提取液試樣0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計測定732 nm下的吸光度A；

(2)準 備50%乙醇(體積分數(shù)，下同)0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計測定732 nm下的吸光度B；

(3)準備評價金釵石斛提取液試樣0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加50%乙醇1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計測定732 nm 下的吸光度C。ABTS自由基清除率計算公式見式(2-2)

(2-2)

式(2-2)中：

A為試樣溶液與ABTS溶液混合后OD值；

B為50%乙醇與ABTS溶液混合后OD值；

C為50%乙醇與試樣溶液混合后OD值。

2 結果

2.1 金釵石斛植物提取液的保濕性能和效果

由表1可見，與使用前相比，S1在使用1 h后和 2 h后皮膚水分含量均顯著性增加，S2在使用 1 h后皮膚水分含量顯著性增加，CK組在使用后各時間點皮膚水分含量均無顯著性變化。

與CK組相比，S1和S2在使用 1 、2 、4 h后，皮膚水分含量的上升率均大于CK組，且在各時間點均與CK組間在統(tǒng)計學上有顯著性差異。

S1與S2相比，在使用后各時間點，兩組間在統(tǒng)計學上均無顯著性差異。

表1 皮膚水分含量檢測結果

2.2 金釵石斛植物提取液對角質形成AQP3表達效果的影響

試驗采用熒光顯微鏡拍照，其中綠色熒光部分顯示的是AQP3蛋白表達情況。試驗結果表明(圖2)，使用金釵石斛提取液后熒光強度明顯增高，說明金釵石斛提取液可以有效的提高角質形成細胞水通道蛋白 AQP3的表達。

圖1 金釵石斛提取液對角質形成細胞中水通道蛋白AQP3的表達的影響Fig.1 The effect of D. mobile extraction on the expression of aquaporin AQP3 in keratinocytes

2.3 金釵石斛植物提取液對FLG及CLDN-1 mRNA表達效果的影響

構建以上角質形成細胞模型，采用qRT-PCR方法分析金釵石斛提取液對角質形成細胞絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA表達的影響。結果表明(圖2、圖3)，0.25 mL/L處理組較空白對照組無明顯差異，0.5 mL/L處理組的mRNA擴增倍數(shù)遠高于空白對照組，故高濃度金釵石斛提取液可有效提高角質形成細胞絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白LDN-1 mRNA的表達。

圖2 金釵石斛提取液對角質形成FLG mRNA的表達的影響Fig.2 Effects of liquid addition on mRNA expression of filaggrin FLG in keratinocytes

圖3 金釵石斛提取液對角質形成細胞緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA的表達的影響Fig.3 Effects of liquid enrichment element on the expression of CLDN-1 mRNA in keratinocytes

2.4 金釵石斛植物提取液對皮膚表面活性的影響

使用皮膚測試儀評估受試者使用金釵石斛提取液前后肌膚鱗屑的改善情況，圖像中白色代表剝落的角質。結果表明(圖4)，試驗組測試區(qū)域涂抹含S1 4 h后，肌膚的鱗屑狀態(tài)相對于涂抹前有顯著改善(圖4A、圖4B)；而空白組測試區(qū)域在涂抹CK 4 h后，肌膚因水分蒸發(fā)起屑狀態(tài)相對于涂抹前更加嚴重(圖4C、圖4D)。說明金釵石斛提取液可即時撫平肌膚因干燥引起的鱗屑，潤澤肌膚。

圖4 金釵石斛提取液撫平肌膚因干燥引起的鱗屑的效果Fig. 4 The effect of D. mobile extraction on smoothing the scale of skin caused by dryness

2.5 金釵石斛植物提取液的抗氧化活性能力

由圖5可知，金釵石斛提取液具有一定的清除ABTS自由基活性，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著受試濃度的增加，對ABTS自由基的清除率越大。結果說明金釵石斛提取液在生化水平具有一定的抗氧化活性。

圖5 金釵石斛提取液對ABTS自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radical by D. mobile extraction

3 討論

生物細胞在其代謝過程中可連續(xù)不斷地產(chǎn)生大量自由基。在正常情況下，機體會不斷產(chǎn)生多種內(nèi)源性抗自由基的活性物質，但在光輻射或其他內(nèi)外環(huán)境異常情況下，體內(nèi)抗自由基系統(tǒng)平衡破壞，引起生物膜的脂質過氧化，破壞生物膜的功能和結構完整性，最終會導致皮膚的損傷和衰老[18]。而研究表明石斛有效成分包括生物堿、多糖、微量元素和氨基酸等成分[14]，作用于肌膚可發(fā)揮良好的保濕功效。有研究表明[15]，金釵石斛復方提取液可以促進角質細胞水通道蛋白AQP3、緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-1的表達，增強細胞的滲透能力，具有良好的鎖水、保濕作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)的金釵石斛可以促進角質細胞水通道蛋白AQP3的表達結果一致。翟東輝等[17]研究表明，石斛多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的活性，起到保護生物膜和延緩衰老的作用。本試驗補充了金釵石斛提取液對ABTS自由基清除的能力，這與黃小燕等[19]發(fā)現(xiàn)的金釵石斛提取物具有良好的抗氧化能力的結果相符。此外，本試驗也證明了金釵石斛還可以提高絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA表達效果，足以說明金釵石斛可以充分利用于化妝品的開發(fā)和研究。

金釵石斛的現(xiàn)代研究已有幾十年歷史，在化妝品領域中應用也日益增多。近些年來，國內(nèi)外一些著名化妝品公司已推出一系列含有金釵石斛提取液的護膚品。研究表明金釵石斛作用于皮膚，確有保濕、美白、延緩衰老等作用，但至今還未發(fā)現(xiàn)具有這些作用的化學成分，其保濕、免疫抑制、鈣通道抑制、抗氧化和延緩衰老、抗炎美白等作用在化妝品中的應用研究仍有很大發(fā)展空間。相信隨著分離技術的提高和研究內(nèi)容的深入，金釵石斛及其復方作為天然植物活性添加劑在化妝品中應用將越來越廣。