何 凱，閆文朝，孫晨陽，趙立卓，王天奇

結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantioidescoli，簡稱小袋蟲)是一種常見的人獸共患寄生性原蟲，寄生于人和豬等宿主的結(jié)腸和盲腸，主要引起腹瀉[1-3]，偶爾可以引起人的泌尿生殖道、肺臟等腸外感染[4-6]。結(jié)腸小袋纖毛蟲的發(fā)育過程可分為滋養(yǎng)體和包囊2個階段，在豬和豚鼠等動物的盲腸和結(jié)腸內(nèi)以滋養(yǎng)體形式存在，在直腸和排出的新鮮糞便中能發(fā)現(xiàn)大量滋養(yǎng)體和少量包囊，其中隨糞便排出的滋養(yǎng)體在體外干燥等逆環(huán)境下，大多滋養(yǎng)體崩解死亡，還有一部分會形成具有感染活性的包囊[1-2]。宿主直腸內(nèi)和體外的逆環(huán)境因素能促使小袋蟲滋養(yǎng)體形成包囊。

目前小袋蟲已經(jīng)成功建立了滋養(yǎng)體體外人工培養(yǎng)技術(shù)，可以實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的體外擴(kuò)增和傳代[7-9]，但是小袋蟲滋養(yǎng)體的體外人工成囊條件尚未報道，進(jìn)而阻礙了對小袋蟲致病性的研究。既往研究證實[10-13]，四膜蟲(Tetrahymenarostrata)、貽貝棘尾蟲(Stylonychiamytilus)和似組毛蟲(Histriculussimilis)等纖毛蟲在體外干燥、溫度驟變、饑餓或缺乏必要營養(yǎng)物質(zhì)等不利條件下能形成包囊，當(dāng)體外恢復(fù)最佳生長培養(yǎng)條件時又會脫囊逸出。因此，本研究參考其他纖毛蟲成囊條件[10-12]，通過體外篩選與優(yōu)化小袋蟲滋養(yǎng)體成囊條件，為研究小袋蟲的感染性和致病性提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1蟲株 采自洛陽市伊川縣某豬場自然發(fā)病豬的新鮮糞便，帶回實驗室鏡檢發(fā)現(xiàn)大量運(yùn)動活躍的滋養(yǎng)體，然后用已報道的改進(jìn)型DMEM培養(yǎng)基于28 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增和傳代[9,14]，鏡檢取滋養(yǎng)體密度大的培養(yǎng)物進(jìn)行后續(xù)體外成囊條件篩選與優(yōu)化試驗。

1.2試驗動物 30 d齡的斷奶仔豬3頭，購自洛陽市伊川縣某豬場，接種前對其進(jìn)行連續(xù)糞檢3 d，確定無結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體、包囊后，隔離飼養(yǎng)待用。

1.3小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊試驗設(shè)計

1.3.1動物糞便的篩選 采集新鮮的正常豬糞便和雞糞便，鏡檢小袋蟲均為陰性。設(shè)置8組，1～4組每組加入5 g豬糞便，5～8組每組加入5 g雞糞便，然后每組加入2 000個滋養(yǎng)體攪拌混勻后，將豬糞便和雞糞便的4個組依次置于37 ℃溫箱、28 ℃溫箱、室內(nèi)(15 ℃～20 ℃)和室外(-11 ℃～-2 ℃)環(huán)境中，孵育24 h后，糞便直接涂片法在10倍物鏡下鏡檢。為避免漏檢，需對陰性樣品重復(fù)制片鏡檢3次，未見包囊者方可判為陰性。

1.3.2孵育液的篩選 選取蒸餾水、0.9%生理鹽水、PBS、DMEM培養(yǎng)基為孵育液，4種孵育液均不加小牛血清和淀粉，每種孵育液組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)溶液體積為1 mL，每個重復(fù)加入2 000個滋養(yǎng)體混勻后，置于28 ℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h后，鏡檢是否有包囊形成，并顯微測量包囊或滋養(yǎng)體的大小。

1.3.3Ca2+濃度的篩選 選擇蒸餾水和生理鹽水為孵育液，配制0.2 mol/L CaCl2儲存液，參考有關(guān)文獻(xiàn)[7]，每種孵育液設(shè)置0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.16 mol/L共6個梯度，每個梯度加入2 000個滋養(yǎng)體，總體積為1 mL，混勻置于28℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h后，鏡檢Ca2+濃度對小袋蟲成囊的影響情況。

1.3.4pH值的優(yōu)化 首先用蒸餾水配制5%(v/v)醋酸和10%(m/v)氫氧化鈉溶液，用于調(diào)節(jié)pH值。選取蒸餾水和0.9%生理鹽水為孵育液，每種孵育液設(shè)置pH為1-10共10個梯度，每個梯度加入2 000個滋養(yǎng)體混勻后，置于28 ℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h后，鏡檢并顯微測量包囊或滋養(yǎng)體的大小，按照1.4部分的方法計算成囊率。

1.3.5溫度的優(yōu)化 選取0.9%生理鹽水為孵育液，用5%醋酸調(diào)節(jié)pH至4，設(shè)置室外(-11～-4 ℃)、室溫(15～20 ℃)、28 ℃、37 ℃ 4個孵育溫度，每個溫度3個重復(fù)，每個重復(fù)樣品中加入2 000個滋養(yǎng)體混勻后，分別放置室外、室溫、28 ℃和37 ℃溫箱孵育24 h后，鏡檢，觀察溫度對成囊的影響。

1.3.6靜置和振蕩培養(yǎng)的影響 選取0.9%生理鹽水為孵育液，用5%醋酸調(diào)節(jié)pH至4，將1 mL pH4的生理鹽水加入1.5 mL無菌離心管中，然后加入2 000個滋養(yǎng)體混勻，放入28 ℃的恒溫箱和轉(zhuǎn)速為120 r/min的28 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)孵育24 h后，鏡檢，觀察靜置和振蕩培養(yǎng)對成囊的影響。靜置和振蕩培養(yǎng)分別設(shè)置3個重復(fù)。

1.4小袋蟲滋養(yǎng)體成囊率的計算 為評價1.3中不同條件下小袋蟲滋養(yǎng)體成囊效果，參考有關(guān)文獻(xiàn)[14]，我們用倍比稀釋法來計數(shù)包囊數(shù)量，然后根據(jù)公式計算小袋蟲滋養(yǎng)體成囊率。孵育24 h后，如果鏡檢觀察到包囊，用微量移液器吸取100 μL混勻的孵育懸液，用生理鹽水10倍稀釋后，取20 μL稀釋懸液滴于在載玻片上，于4倍物鏡下計完20 μL稀釋懸液中包囊數(shù)量n，然后換算出每毫升孵育懸液中包囊數(shù)量N=n×50×10。由于上述每個重復(fù)或組中加入的滋養(yǎng)體數(shù)量均為2 000，因此，計算成囊率A=(N/2000)×100%即可。

1.5動物接種試驗 用無小袋蟲斷奶仔豬3頭，編號1～3號，1、2號仔豬用導(dǎo)胃管灌服2×104個體外成囊的小袋蟲包囊懸液，3號仔豬接種生理鹽水作為陰性對照。接種后第3 d開始連續(xù)糞檢1周，看是否排出小袋蟲滋養(yǎng)體或包囊[15]。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)用EXCEL整理，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的One-way ANOVA方法對不同孵育液、Ca2+濃度、pH值、溫度、靜置和振蕩培養(yǎng)處理組小袋蟲滋養(yǎng)體成囊率進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)α為0.05或0.01。

2 結(jié) 果

2.1 小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1動物糞便篩選 將滋養(yǎng)體與豬和雞的正常糞便混合孵育24 h后，室溫(15 ℃～20 ℃)、28 ℃和37 ℃下均沒有發(fā)現(xiàn)形成包囊，只在28 ℃的豬糞便中觀察到少量滋養(yǎng)體，其他各組中均沒發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體，48 h后，28 ℃的豬糞便中也觀察不到滋養(yǎng)體。

孵育液篩選試驗結(jié)果顯示，孵育24 h后，蒸餾水組中既沒有觀察到包囊，也沒看到滋養(yǎng)體；生理鹽水組和PBS組中看到大量的滋養(yǎng)體和少量的早期包囊； DMEM組中觀察到大量滋養(yǎng)體，沒有包囊形成(表1)。

表1 小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊孵育液的篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of incubation solution of B.coli trophozoite encysted in vitro

2.1.2Ca2+濃度篩選 結(jié)果顯示，含不同Ca2+濃度的蒸餾水中均沒有觀察到包囊和滋養(yǎng)體；含不同Ca2+濃度的生理鹽水中能觀察到少量早期包囊，不同Ca2+濃度組的成囊率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.369，P>0.05)(表2)。

2.1.3pH值對小袋蟲滋養(yǎng)體成囊影響的驗證 在10個梯度的pH值的蒸餾水和生理鹽水中的滋養(yǎng)體經(jīng)過24 h的孵育，鏡檢結(jié)果顯示，pH值在 1～10的蒸餾水中均沒觀察到滋養(yǎng)體和包囊；pH值 2～7的生理鹽水中均觀察到包囊，其中pH值 3～5的生理鹽水中包囊比例升高(F=39.926，P<0.01)，平均成囊率高達(dá)33.7%，而pH值1和8～10的生理鹽水中觀察不到包囊和滋養(yǎng)體(表3)。

表2 小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊Ca2+濃度篩選結(jié)果Tab.2 Ca2+ concentration screening results of B.coli trophozoite encysted in vitro

表3 小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊pH值的優(yōu)化結(jié)果Tab.3 pH optimization results of B.coli trophozoite encysted in vitro

成囊溫度優(yōu)化結(jié)果顯示，室外(-11 ℃～-4 ℃)、室溫(15 ℃～20 ℃)、28 ℃組的成囊率明顯高于37 ℃組(F=62.143,P<0.05)，而室外(-11 ℃～-4 ℃)、室溫(15 ℃～20 ℃)、28 ℃組間的成囊率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。說明15 ℃～28 ℃是小袋蟲滋養(yǎng)體成囊的適宜溫度。

另外，靜置孵育和振蕩孵育均有包囊形成，但二者的成囊率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明溶液中的氧含量對小袋蟲的成囊影響不明顯。

注：體外：-11 ℃～-4 ℃；室溫：15 ℃～20 ℃；與28 ℃組相比，*：成囊率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。圖1 小袋蟲滋養(yǎng)體體外成囊溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Temperature optimization results of B.coli trophozoite encysted in virto

2.2體外成囊的顯微鏡觀察結(jié)果 在不加小牛血清和淀粉的pH 2～7的生理鹽水中，小袋蟲滋養(yǎng)體形成的包囊主要有兩種，一種呈球形褐色，壁明顯、光滑無纖毛，靜止不運(yùn)動的成熟包囊，大小為48.9 μm～60.3 μm，相對于滋養(yǎng)體，體積縮小；另一種是內(nèi)含淀粉顆粒、顏色較淺、壁較薄的球形早期包囊，大小為53.5 μm～85.8 μm，相對于成熟包囊，體積較大(圖2)。而在改進(jìn)型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的滋養(yǎng)體多呈不對稱的卵圓形，前端稍尖，有一明顯胞口，后端鈍圓，也有其他形狀，大小為(32.4～130.6) μm×(23.5～121.3)μm；周圍布滿不停擺動的纖毛，帶動滋養(yǎng)體做旋轉(zhuǎn)向前運(yùn)動；內(nèi)部存在大量淀粉顆粒和大核等結(jié)構(gòu)，與前面兩種包囊形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小上明顯不同。

注：圖片中刻度尺代表50 μm(200倍)圖2 pH值 3～5的生理鹽水中小袋蟲滋養(yǎng)體(A)、早期包囊(B)和成熟包囊(C～F)Fig.2 Different stage of B.coli in saline solution with pH 3～5: trophozoite stage(A)；early stage cyst(B); mature stage cyst(C～F). Bar=50μm(200×)

2.3動物接種試驗結(jié)果 在接種后第4 d，開始在1號和2號仔豬的性狀變稀的糞便中發(fā)現(xiàn)少量滋養(yǎng)體(圖3)，沒有發(fā)現(xiàn)包囊，一直持續(xù)到試驗結(jié)束。在整個試驗過程中，作為對照的3號仔豬沒有排出滋養(yǎng)體與包囊。說明體外形成的包囊具有感染活性。

圖3 接種包囊的仔豬排出小袋蟲滋養(yǎng)體(200倍)Fig.3 Trophozoites of B.coli in feces of piglets inoculated with cysts (200×)

3 討 論

小袋蟲病是一種食源性人獸共患寄生蟲病，也是豬場最常見的寄生蟲病之一，是斷奶仔豬腹瀉的常見病因，嚴(yán)重影響斷奶仔豬的成活率和生長速度，給豬場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14-17]。小袋蟲病對動物的致病性主要是根據(jù)豬場自然感染病例臨床觀察的初步結(jié)果，由于目前小袋蟲滋養(yǎng)體體外人工成囊尚未實現(xiàn)，不能獲取大量感染性包囊用于動物感染試驗，導(dǎo)致對小袋蟲的感染性和致病性的理解比較模糊。本研究通過不同動物糞便、不含血清和淀粉的孵育液、鈣離子濃度、pH值、溫度、氧含量等條件的篩選和優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)，不含血清和淀粉的pH值為3～5的0.9%生理鹽水與小袋蟲滋養(yǎng)體在15 ℃～28 ℃孵育，可形成大量的包囊，這些結(jié)果對進(jìn)一步研究小袋蟲感染性和致病性提供有效途徑。

大多數(shù)纖毛蟲遇到饑餓、溫度驟變、濕度變化、蟲體密度過高、代謝產(chǎn)物濃度過高、鈣離子濃度、酸堿度和氧含量變化等不利因素，會形成休眠性包囊，其中饑餓和溫度變化被認(rèn)為是纖毛蟲成囊的主要原因[13,18]。在包囊形成過程中，要經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)大量水分流失，細(xì)胞皮層的纖毛器、毛基體和微管結(jié)構(gòu)會全部或部分被吸收，細(xì)胞質(zhì)團(tuán)縮化和核物質(zhì)濃縮，細(xì)胞合成和分泌一些物質(zhì)形成包囊壁，最后形成球形包囊，其最明顯的一個變化就是體積縮小大約60%～80%[18]。據(jù)報道，將包囊游仆蟲(Euplotesencysticus)接入食物耗盡的培養(yǎng)液中，在不提供食物的情況下1～2 h后即可形成包囊[13]。生活在土壤中的僧帽腎形蟲(Colpodacucullus)夜間在土壤濕潤時正常活動，白天在地表露水干涸前形成包囊[19]。在饑餓狀態(tài)下，四膜蟲(Tetrahymenarostrata)在18 ℃～25 ℃成囊達(dá)到高峰，10 ℃時，成囊效率開始下降，5 ℃時成囊停止[10]。營寄生生活的多子小瓜蟲在魚皮膚和鰓上是以滋養(yǎng)體形式存在，離開魚體在水中是包囊形式存在[13]。會造成人類感染的棘阿米巴(Acanthamoeba)遭受營養(yǎng)缺乏或滲透壓力時，也會啟動分化過程形成包囊，使其能夠在惡劣的條件下生存，并抵抗消毒藥物的殺傷[21]。寄生于人、豬和豚鼠等宿主的盲腸和結(jié)腸內(nèi)小袋蟲以滋養(yǎng)體形式存在，而到直腸和體外會形成休眠性包囊，是其自我保護(hù)的一種生存策略，有利于小袋蟲在動物和人群中的傳播和存在[1-2,13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在小袋蟲滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)化為包囊過程中，饑餓環(huán)境和pH值是影響小袋蟲成囊的主要因素。小袋蟲滋養(yǎng)體在不含血清和淀粉的接近中性的生理鹽水中孵育能形成少量的早期包囊，當(dāng)改變孵育液生理鹽水的pH值為3～5時，成囊率明顯提高，并且可以看到典型的成熟包囊。但是過高或過低的pH值的孵育環(huán)境會快速將滋養(yǎng)體殺死而來不及形成包囊。研究發(fā)現(xiàn)[9]，改進(jìn)型DMEM培養(yǎng)基pH在6.5～7.4小袋蟲滋養(yǎng)體生長良好，但是pH值低于6或高于8時，滋養(yǎng)體數(shù)量和活性明顯下降，逐漸崩解消失，卻不會形成包囊。其原因可能是：雖然DMEM培養(yǎng)液的pH值低于6或高于8不利于滋養(yǎng)體生長，但是培養(yǎng)體系中依然有小牛血清、淀粉和其他營養(yǎng)成分，不是一個饑餓環(huán)境，使滋養(yǎng)體也不能形成包囊。而不含血清和淀粉的生理鹽水僅僅維持一個正常的滲透壓，可以營造一個饑餓環(huán)境，再加上pH值為3～5的不利環(huán)境，更有利于滋養(yǎng)體形成包囊。在pH值低于2和高于8的不含血清和淀粉的生理鹽水中滋養(yǎng)體也不能形成包囊，其原因可能是孵育體系酸堿度過高或過低，快速將滋養(yǎng)體殺死而來不及形成包囊。Fouque等[22]通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中KCl濃度研究滲透壓對哈曼屬(Hartmannella)阿米巴蟲的成囊機(jī)制的影響時，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)若孵育環(huán)境缺乏KCl，細(xì)胞會發(fā)生膨脹并最終被溶解，當(dāng)KCl濃度達(dá)到0.5 mol/L時，細(xì)胞會嚴(yán)重收縮，從而抑制了包囊的形成。說明滲透壓也是影響包囊形成的重要的因素。另外，本研究用相同pH值范圍的蒸餾水與小袋蟲滋養(yǎng)體共孵育，不僅不能形成包囊，而且也看不到滋養(yǎng)體。更加證實了低滲環(huán)境不利于滋養(yǎng)體的存活和形成包囊。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度、鈣離子濃度和氧含量的變化對小袋蟲成囊沒有明顯影響，其中溫度的改變卻是大部分纖毛蟲形成包囊的主要原因[13,18]。另外，我們在小袋蟲滋養(yǎng)體體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，長期不更換培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液“老化”，不會形成包囊，反而滋養(yǎng)體逐漸崩解死亡?？傊?，這些與其他相關(guān)纖毛蟲的成囊條件不一致[18-20]，可能與纖毛蟲的種類不同有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

小袋蟲滋養(yǎng)體體外人工成囊是否成功的2個標(biāo)志是：是否具有包囊的典型特征；形成的包囊是否具有感染活性[15,21]。為檢驗本研究體外形成包囊的感染性，本研究將體外形成的包囊懸液接種給斷奶仔豬，從接種的兩頭仔豬糞便均檢測到小袋蟲滋養(yǎng)體，說明本研究體外形成的小袋蟲包囊具有感染活性。成功實現(xiàn)小袋蟲體外人工成囊試驗將為進(jìn)一步研究小袋蟲不同分離株的感染性和致病性提供有效途徑。

利益沖突：無