祁義軍 趙文娣 王正林 楊書瀚 汪正廣

轉(zhuǎn)錄因子Gli（Glioma-associated Oncogene homoglog）是Shh通路的重要組成部分，也是Shh信號(hào)通路的靶基因[1]。阻斷腫瘤細(xì)胞中的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路某個(gè)節(jié)點(diǎn)，有可能為腫瘤的靶向治療提供一個(gè)新的途徑[2]。前期的研究[3]我們發(fā)現(xiàn)GIST中有Shh信號(hào)通路的存在，且與GIST的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機(jī)制不清。PI3K信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路是目前已被證明與GIST關(guān)系密切的信號(hào)通路[4]，為探討Shh信號(hào)通路在GIST中是否與PI3K和MAPK信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，我們用Western方法檢測(cè)了我院一年間手術(shù)的GIST患者標(biāo)本，并分析其相互間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑

1.1.1 標(biāo)本 145例標(biāo)本選自2013年1月-12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的GIST患者，臨床資料完整。術(shù)前均未接受其他治療（如化療或放療）。標(biāo)本處理：中性福爾馬林（10%）固定后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），HE染色。病理診斷由兩位病理醫(yī)師閱片共同診斷核實(shí)。

1.1.2 試劑 主要試劑來源：Anti-Tubulin Ab購自Sigma，p-AKT Ab 、p-ERK1/2 Ab購自Cell Signaling，Anti-AKT Ab和Anti-ERK1/2 Ab購自BioWorld，Anti-Gli-1Ab購自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 石蠟組織提取蛋白 ①取厚約10～15 um的石蠟切片兩塊，取100 mm2石蠟組織切片放入離心管，加入預(yù)處理試劑A1 mL，30 s高速渦懸震蕩后再5 min室溫靜置；加入100 uL預(yù)處理試劑B，渦懸震蕩（10 s）后離心。②脫蠟組織清洗兩次后保留的組織塊予以沉淀；加入提取試劑100 uL，震蕩后予20 min 100 ℃加熱，離心后切片組織用組織研磨棒磨碎。③2 h 60 ℃加熱后離心15 min（4 ℃，12000 rpm)，加入沉淀試劑1 mL，震蕩后4 ℃靜置10 min；15 min離心(4 ℃，12000 rpm)，去上清液留沉淀。④加入沉淀試劑0.5 mL加入后10 s震蕩，靜置10 min 4 ℃后離心15 min（4 ℃，12000 rpm）。⑤僅保留沉淀，離心管倒置濾紙上（通風(fēng)櫥中），使殘余液體揮發(fā)完全；組織裂解液溶解固體沉淀，15 min沸水浴，10 min離心（4 ℃，12000 rpm），收集上清液后上樣分析。

1.2.2 免疫印跡 ①垂直電泳：采用SDS-PAGE凝膠垂直電泳，同時(shí)使用蛋白質(zhì)預(yù)染Marker，電壓設(shè)定：濃縮膠電泳電壓恒壓80 V；分離膠電泳電壓恒壓120 V。②轉(zhuǎn)膜：取厚濾紙兩張，PVDF膜一張，大小90 mm×70 mm，PVDF膜在甲醇中潤濕后，再同濾紙一起浸透于轉(zhuǎn)移緩沖液。放置于轉(zhuǎn)膜夾上的順序（由上而下）為海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿。轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓：恒流220 mA，時(shí)間1.5～2 h。③封閉：待轉(zhuǎn)膜完成后取出PVDF膜，置10 mL含有5%BSA的1×TBST封閉液，將其在60 rpm/min的水平搖床上封閉1 h（室溫）。④一抗：5%BSA的1×TBST配制非標(biāo)記抗體，PVDF膜（封閉后的）放入一抗中，1 h室溫孵育后洗膜3次。⑤二抗：HRP酶標(biāo)二抗用含5%BSA的1×TBST配制，放入二抗后1 h室溫孵育，洗膜3次。⑥顯影：PVDF膜上均勻涂布MilliPore顯影液（A液與B液按1:1混勻），吸干顯色液（反應(yīng)1 min后），X光片曝光，顯影用顯影液及定影液，顯影好的X光片晾干。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS（16.0 for window）軟件，根據(jù)資料性質(zhì)分別采用卡方檢驗(yàn)各蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)間關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Pearson分析各蛋白表達(dá)相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病例資料 145例GIST患者中，男80例（55.2%），女65例（44.8%），年齡18～84歲，平均年齡（60.52±11.42）歲，中位年齡62歲。其中胃間質(zhì)瘤84例（57.9%），小腸間質(zhì)瘤32例（22.1%），結(jié)直腸間質(zhì)瘤6例（4.1%），食管間質(zhì)瘤2例（1.4%），胃腸外間質(zhì)瘤21例（14.5%）。①腫瘤大?。鹤畲笾睆健?.0 cm者35例（24.1%），2.1～5.0 cm者48例（33.1%），5.1～10.0 cm者37例（25.5%），＞10.1 cm者25例（17.2%）。②NIH危險(xiǎn)度分級(jí)：極低危險(xiǎn)度26例（17.9%）；低度危險(xiǎn)度41例（28.3%）；中度危險(xiǎn)度30例（20.7%）；高度危險(xiǎn)度48例（33.1%）。見表1。

2.2 Western-blot檢測(cè)不同危險(xiǎn)程度GIST中Gli1、p-AKT和p-ERK的表達(dá) 如圖1所示：Western blot檢 測(cè) 不 同 危 險(xiǎn) 程 度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達(dá)，GelDoc測(cè)量Gli-1與Tubulin、p-AKT與AKT、p-ERK與ERK的灰度相對(duì)比值，結(jié)果顯示：在不同危險(xiǎn)程度GIST組織中，其Gli-1與 Tubulin、p-AKT與AKT、p-ERK與ERK的灰度相對(duì)比值與危險(xiǎn)程度分級(jí)呈正相關(guān)，隨著危險(xiǎn)等級(jí)的升高，Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達(dá)也上升，且升高具有一致性（相關(guān)系數(shù)0＜r＜1，P＜0.01）。

圖1 Western Blot檢測(cè)不同危險(xiǎn)程度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達(dá)

3 討 論

脊椎動(dòng)物中，Shh信號(hào)通路包括了Hh配體、Patched（Ptch）受體、G蛋白偶聯(lián)的磷酸化受體（Smo）、核轉(zhuǎn)錄因子Gli四個(gè)部分。Zhao C等[5]研究發(fā)現(xiàn)抑制Shh信號(hào)通路時(shí)，可降低野生型BCR-ABL1的慢性粒細(xì)胞白血?。–ML)的傳播，且可降低伊馬替尼耐藥的CML腫瘤細(xì)胞的生長。伊馬替尼也是治療GIST的一線藥物，因而Shh信號(hào)通路是否在伊馬替尼耐藥的GIST治療中起作用引起研究者的興趣。我們前期研究[4]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GIST中有Shh信號(hào)通路的存在，且與GIST的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機(jī)制不清。

PI3K主要由催化亞單位P110和調(diào)節(jié)亞單位P85構(gòu)成。細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后使PI3K活化，生成的PI-3，4，5-P3即作為第二信使，進(jìn)一步通過磷酸化而活化其下游的Akt蛋白。PI3K/Akt信號(hào)能促進(jìn)腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路在GIST中有表達(dá)，且隨著GIST危險(xiǎn)度分級(jí)的升高，PI3K/Akt表達(dá)逐漸上調(diào)，表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與了GIST的發(fā)生發(fā)展過程。

目前發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路共有8個(gè)亞家族，最早被發(fā)現(xiàn)和目前了解最多的是成員亞族ERK。ERK1/2作為重要傳遞者將信號(hào)從細(xì)胞膜外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，ERK1/2活化以后可以進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)重要轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等。我們的研究雖發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路在GIST的發(fā)生發(fā)展中起作用，但是其具體作用機(jī)制目前報(bào)道仍較少。本組資料中，MAPK信號(hào)通路中ERK在所有不同危險(xiǎn)度組均有不同程度的表達(dá)，表明ERK可能參與了GIST的發(fā)生、發(fā)展過程。王春萌等[6]報(bào)道MAPK通道蛋白在GIST中均有陽性表達(dá)，其表達(dá)在GIST耐藥標(biāo)本及藥物敏感標(biāo)本間無區(qū)別（該組資料對(duì)8例GIST患者進(jìn)行檢測(cè)），因此仍需多中心大樣本的研究。

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，不同的信號(hào)通路間可有交叉調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)GIST中PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK/ERK信號(hào)通路和Shh信號(hào)通路均有表達(dá)，表明上述三條信號(hào)通路均參與了GIST的發(fā)生發(fā)展過程。其表達(dá)的強(qiáng)度密切相關(guān)，具有高度一致性，表明上述三條通路在GIST中可能具有交叉聯(lián)系。由此推測(cè)：Shh信號(hào)通路在GIST的發(fā)生發(fā)展中起作用，通過與業(yè)已被證明在其中起重要作用的PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK/ERK信號(hào)通路之間的交叉聯(lián)系可能是其機(jī)制之一。此發(fā)現(xiàn)將為尋找治療GIST 的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。