羅 蘭，朱思宇，許芳穎，周思雨，苗艷華，談建中

(蘇州大學(xué) 建筑學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

1 引言

高等植物葉色突變是比較常見的一種表型突變，以黃化和白化較為常見，這通常是由于突變基因影響了葉綠體的發(fā)育或者是葉綠素的合成降解過(guò)程所導(dǎo)致[1]。紅掌(Anthuriumandraeanum)作為市場(chǎng)上重要的盆花、鮮切花及景觀裝飾植物，研究紅掌葉色突變體的呈色機(jī)理對(duì)于新奇葉色品種的選育有重要的意義，而對(duì)于紅掌葉色突變體的研究較少。目前已有研究表明紅掌不同葉片顏色中所含的葉綠體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量都有差異，這直接影響了葉綠素合成及色素生物活性[2]，但對(duì)其葉綠素代謝變化沒(méi)有深入的研究。本研究以紅掌品種“阿拉巴馬”及其葉色黃化突變體為試驗(yàn)材料，研究其葉綠素及中間代謝產(chǎn)物的含量變化，旨在揭示其突變體類型和黃化的生理機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試材料為紅掌品種“阿拉巴馬”(野生型)的幼葉(CK-Y)、成熟葉(CK-M)和老葉(CK-A)以及葉色突變體的幼葉(Mut-Y)、成熟葉(Mut-M)和老葉(Mut-A)。葉片經(jīng)雙蒸水清洗后用濾紙擦干，液氮速凍后放置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 葉色表型調(diào)查

使用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(RHSCC)對(duì)野生型及其葉色突變體葉片的顏色類型進(jìn)行分析。

2.3 葉片葉綠素含量的測(cè)定

不同葉片的葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)含量的測(cè)定參照李合生[3]的方法，稱取0.2 g葉片，浸入10 mL體積比為1∶1的丙酮與無(wú)水乙醇混合液中，在黑暗條件下浸提48 h，并不時(shí)震蕩搖晃，直到葉片完全褪色變白。將上述混合液作為空白對(duì)照，分別在波長(zhǎng)為663、645 nm處測(cè)定提取液的吸光度(Optical density，OD)值，上述步驟重復(fù)三次，測(cè)得的OD值代入下列公式進(jìn)行計(jì)算。

Chl a含量(mg·g-1)=(12.7×A663-2.697×A645)7×V/(1000W)

(1)

Chl b含量(mg·g-1)=(22.77×A645-4.687×A663)7×V/(1000W)

(2)

式(1)、(2)中A663、A645分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下的OD值，V為混合液體積，W為供試葉片的質(zhì)量。

2.4 葉綠素生物合成中間代謝產(chǎn)物的測(cè)定

δ-氨基酮戊酸(ALA)的測(cè)定參照張帆[4]等人的方法進(jìn)行測(cè)定；膽色素原(PBG)、尿卟啉原III(Urogen III)和糞卟啉原III(Coprogen III)的測(cè)定參照Bogorad[5]的方法；原卟啉IX(Proto IX)、鎂原卟啉IX(Mg-Proto IX)和原葉綠素酸酯(Pchl)的測(cè)定參照楊海蕓[6]的方法進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅掌“阿拉巴馬”葉色突變體的表型特征

野生型幼葉(CK-Y)呈正常的綠色泛紅，野生型成熟葉(CK-M)呈深綠色，野生型老葉(CK-A)與CK-M相差不大，同樣呈深綠色。突變體幼葉(Mut-Y)顏色呈現(xiàn)橘黃色，突變體成熟葉(Mut-M)呈黃綠色，突變體老葉(Mut-A)除邊緣衰老變黃外，其他部分略有轉(zhuǎn)綠。從葉色表型來(lái)看，該突變體屬于葉色黃化突變體(圖1)。

2.2 紅掌野生型與葉色突變體葉綠素含量的比較分析

采用浸提法分別對(duì)紅掌野生型及葉色突變體的幼葉、成熟葉、老葉中的葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。在三個(gè)發(fā)育階段中，突變體中Chl a和Chl b的含量均顯著低于野生型，但隨著葉片發(fā)育的成熟而逐漸升高。其中，Mut-Y中Chl a和Chl b的含量分別為CK-Y的20.42%和20.93%，總?cè)~綠素含量下降了79.41%；Mut-M中Chl a和Chl b的含量分別為CK-M的26.36%和20.26%，最終總?cè)~綠素含量下降了75.37%；Mut-A中Chl a和，Chl b的含量分別為CK-A的48.59%和58.49%，最終總?cè)~綠素含量下降了48.59%。其次，從Chla/Chlb的比值來(lái)看，在突變體的幼葉、成熟葉和老葉中分別為3∶1.49、3∶0.91和3∶1.44，平均值為3∶1.28，野生型幼葉、成熟葉和老葉的Chla/Chlb之比分別為3∶1.45、3∶1.19和3∶1.19，其平均值同樣為3∶1.28。

注：括號(hào)中數(shù)值為英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡代碼

3.3 紅掌野生型與葉色突變體葉綠素合成中間產(chǎn)物的比較分析

為進(jìn)一步探討葉色突變體中葉綠素缺失的原因，測(cè)定了6種供試材料的葉綠素生物合成中間代謝產(chǎn)物含量，結(jié)果如圖3所示。首先，在突變體幼葉Mut-Y中，其ALA和PBG含量略高于CK-Y，而Proto IX的含量極顯著地降低，僅為CK-Y的14.73%；其下游的Mg-Proto IX和Pchl含量也極顯著地低于CK-Y，僅為CK-Y的3.23%和6.56%，最終導(dǎo)致葉綠素含量極顯著地降低。其次，在突變體成熟葉Mut-M中，其ALA、PBG及Urogen III含量雖然低于CK-M，但Coprogen III出現(xiàn)了大量積累，其下游產(chǎn)物Proto IX的合成均受到阻遏，相對(duì)含量?jī)H為CK-M的36.78%，但與幼葉期相比已有所上升，Chla的相對(duì)含量也有所升高，而Chlb的相對(duì)含量無(wú)顯著性變化。此外，與前兩個(gè)階段不同的是，在突變體老葉Mut-A中，代謝中間產(chǎn)物的相對(duì)含量在Coprogen III處出現(xiàn)了顯著下降的現(xiàn)象，約為CK-A的50%，導(dǎo)致Coprogen III及其后續(xù)產(chǎn)物的相對(duì)含量均有下降。但總體上，相對(duì)于前兩個(gè)階段均有所升高。

圖2 紅掌葉色突變體葉綠素含量的比較

4 討論

高等植物葉綠素生物合成是以L-谷氨酰-tRNA為原料，經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，最終形成Chl a和Chl b，其具體過(guò)程為Glu→ALA→Urogen III→ Coprogen III→Proto IX→ Mg-Proto IX→Pchl→Chl a→Chl b[7]，其中任意一個(gè)步驟受到阻礙均會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成異常。本研究通過(guò)對(duì)葉綠素及其生物合成中間代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體幼葉、成熟葉和老葉中總?cè)~綠素含量分別降低了79.41%、79.58%和79.07%，但Chl a/Chl b的平均值未見差異，均為3:1.28，說(shuō)明該突變體中Chl a和Chl b合成均減少，屬于總?cè)~綠素缺失型突變體。

Proto IX是葉綠素生物合成過(guò)程中十分關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，在金邊黃楊和金心黃楊的不同呈色部位中，發(fā)現(xiàn)黃色部分的葉綠素含量顯著低于綠色部分，其葉綠素合成中間產(chǎn)物Proto IX、Mg-Proto IX以及Pchl的含量均顯著低于綠色部分，推測(cè)Coprogen III合成Proto IX的過(guò)程受阻導(dǎo)致了黃色組織中葉綠素含量的顯著減少[8]。同樣地，在白肋型煙草以及芥菜型油菜黃化突變體L638-y葉片中，也在Coprogen III合成Proto IX時(shí)代謝受阻[9,10]。本研究結(jié)果表明，在突變體幼葉與成熟葉中，Proto IX的積累量極顯著地下降，僅為野生型的14.73%和36.78 %，推測(cè)該突變體的葉片黃化也是在Coprogen III合成Proto IX時(shí)受到了嚴(yán)重阻抑。

圖3 紅掌葉色突變體葉綠素及合成代謝中間產(chǎn)物含量的比較

但不同的是，在突變體老葉中，Coprogen III的積累量顯著下降；并且，Coprogen III下游的中間產(chǎn)物及葉綠素含量雖然都低于野生型，但相對(duì)于幼葉與成熟葉又表現(xiàn)為升高的變化趨勢(shì)，表型上也出現(xiàn)葉色返綠的現(xiàn)象，說(shuō)明其葉綠素合成代謝的受阻部位及程度有所不同。

綜上所述，供試突變體的葉綠素含量雖然隨著葉片發(fā)育而呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，但在整個(gè)生長(zhǎng)期間始終低于野生型，但Chl a/Chl b比值未見差異，屬于總?cè)~綠素缺失型黃化突變體。其次，在突變體的幼葉和成熟葉中，葉綠素合成受阻位點(diǎn)在Coprogen III轉(zhuǎn)化為Proto IX處，而老葉在Urogen III合成Coprogen IIII時(shí)受到阻抑，但抑制作用相對(duì)降低，出現(xiàn)葉色返綠現(xiàn)象，這與前人報(bào)導(dǎo)的葉色突變體類型[2]有所不同，可以認(rèn)為是一種新的紅掌葉色突變體，這在紅掌葉片呈色機(jī)理及品種選育研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。