劉克杰，謝國勇，金書屹，秦民堅

(中國藥科大學 中藥資源系，江蘇 南京 211198)

西紅花(CrocussativusL.)為鳶尾科番紅花屬植物，其原產于伊朗，地中海一帶，后經西藏傳入中國，故又稱番紅花或藏紅花[1-2]。藥用部位為干燥的柱頭，因其用途廣泛，且產量極低，導致西紅花的價格一直居高不下[3]。西紅花中主要的活性成分有西紅花苷、西紅花酸和西紅花苦素等，具有鎮(zhèn)靜安神、涼血解毒、抗炎和提高免疫力的功效[4-5]。網絡藥理學概念最早由安德魯·霍普金斯2007年在Nature Biotechnology上提出，它在基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡的基礎上, 通過分析基因網絡庫、蛋白網絡庫、疾病網絡庫、藥物網絡庫等現有數據庫的信息資料，從系統(tǒng)網絡角度揭示生物系統(tǒng)、藥物成分和疾病之間的復雜關系。網絡藥理學強調系統(tǒng)性、動態(tài)性、多靶點的特征,而中藥方劑中也有“七情配伍”、“君臣佐使”等原則,兩者研究的思路和方式深度契合。利用網絡藥理學工具研究和開發(fā)中醫(yī)藥，傳承與創(chuàng)新結合，有著重要的意義和廣闊的空間[6-8]。

圖1 基于網絡藥理學研究西紅花抗炎作用流程圖Fig.1 The flow chart of anti-inflammatory effect of Crocus sativus L. based on network pharmacology

1 試驗和方法

1.1 西紅花化學成分的收集和處理

通過實驗室前期已經確定的化學成分同時結合已有的西紅花文獻數據，整理得到西紅花化學數據庫。利用TCMSP(http://tcmspw.com/)數據庫，以 Lipinsk類藥性原則和口服吸收利用度(OB≥30%)為標準對西紅花化學數據庫中成分進行篩選，利用Chemdraw17.1軟件繪制得到的有效成分的化學分子式，文件保存為SDF格式[9]。

1.2 西紅花有效成分-靶點網絡的構建

將篩選得到的化學成分上傳至Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫[10]，得到有效成分對應的靶點信息，以Probability值進行降序排列，取前20個靶點作為該化合物對應的靶點，利用Cytoscape3.4.1構建西紅花有效成分-靶點網絡。

1.3 收集相關抗炎靶點信息并構建抗炎靶點-疾病網絡

在Therapeutic Target Database(TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)，Comparative Toxicogenomics Databas(CTD, http://ctdbase.org/)和OMIM(OMIM, https://omim.org/)中以“ant-inflammatory”為關鍵詞檢索得到相關抗炎靶點和對應的疾病信息，構建疾病-抗炎靶點網絡[11-13]。進一步將得到的靶點導入String(https://string-db.org/)數據庫中，得到蛋白質互相作用網絡(PPI)。

1.4 相關靶標匹配以及成分-靶點-疾病網絡的構建

將篩選得到的有效成分對應靶點與疾病對應的靶點進行匹配，利用Cytoscape3.4.1軟件中Merge功能將有效成分-靶點網絡和疾病-抗炎靶點網絡合并，合并后得到西紅花有效成分-抗炎靶點-疾病網絡。

1.5 GO富集分析與KEGG pathway分析

利用DAVID Bioinformatics Resources(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) 對成分-靶點-疾病網絡中的靶點進行基因生物功能學(GO)富集分析和KEGG pathway富集分析。

2 結果

2.1 西紅花化學成分篩選結果

結合Lipinsk類藥性原則和口服吸收利用度(OB≥30%)對西紅花化學數據庫中成分進行篩選，一共得到21個化學成分，結果見表1。21個化學成分均滿足分子量<500，氫鍵給體數目≤5，氫鍵受體數目<10，脂水分配系數<5，可旋轉鍵的數量≤10和口服利用度≥30%的要求。

表1 收集得到的21個可用化學成分

2.2 有效成分-靶點網絡的構建結果

利用Cytoscape3.7.1軟件構建得到西紅花有效成分-靶點網絡，結果見圖2。網絡中共包含節(jié)點205個(其中化合物節(jié)點21個，靶標節(jié)點184個)，作用關系574條。紅色菱形代表西紅花中有效成分，黃色圓形為度值<4的靶點，綠色圓形為度值≥4的靶點。其中度值較高的化合物有西紅花酸、山奈酚、咖啡酸、異鼠李素等；度值較高的靶點有人表皮生長因子受體(EGFR)、人血管內皮生長因子受體2(KDR)、肝細胞生長因子受體(MET)、絲裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)、單胺氧化酶A(MAO A)、等。試驗統(tǒng)計了度值≥4的靶點信息，結果見表2。其中，與信號傳導有關的靶點有EGFR、KDR、MAPK12、MET、FGFR1、SELE、MIF、ERBB2、FLT4、，與代謝過程相關的靶點有MAO A、MAO B、COX-2、FASN。

2.3 構建得到的抗炎相關靶點網絡

將TTD、CTD和OMIM數據庫中篩選得到的抗炎靶點導入Cytoscape3.4.1，得到抗炎-靶點網絡，結果見圖3a。利用String11.0在線數據庫構建得到這些靶點的蛋白質互相作用關系(PPI)網絡，結果見圖3b。圖3a中共有63個與抗炎作用相關的靶點信息，圖3b為這63個靶點之間的相互作用，其中degree值較大的靶點有腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)和人血管內皮生長因子受體2(KDR)。

圖2 西紅花有效成分-靶點網絡Fig. 2 Effective component - target network in safflower

表2 有效成分對應的靶點信息

2.4 西紅花化學成分-靶點-疾病網絡

將化學成分-靶點網絡和抗炎-靶點網絡合并得到西紅花化學成分-靶點-疾病網絡，見圖4。其中西紅花抗炎活性成分14個，主要有西紅花酸、異鼠李素、山奈酚、咖啡酸、苦藏紅花苷酸、藏花醛等；與西紅花發(fā)揮抗炎作用的靶點有13個，分別是EGFR、KDR、PTPRC、MAPK12、APP、MET、FGFR1、LPAR1、SELE、CD38、MIF、ERBB2、DRD2、FLT4。其中，西紅花酸、異鼠李素、山奈酚主要作用于EGFR和MAPK12; 咖啡酸、苦藏紅花苷酸、藏花醛、3,5-二甲基苯甲醛主要作用于KDR、MET和FGFR1。從圖4可以看出，西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸是西紅花發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分，EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2為西紅花發(fā)揮抗炎活性的主要靶點。

圖3a 抗炎相關靶點網絡Fig.3a Ant-inflammation - associated target network

圖3b 抗炎靶點相互作用網絡(PPI)Fig.3b Ant-inflammatory target interaction network (PPI)

圖4 西紅花化學成分-抗炎靶點-疾病網絡Fig. 4 Chemical composition - anti-inflammatory target - disease network in safflower

2.5 GO分析結果和KEGG pathway分析結果

利用David數據庫對預測得到的抗炎靶點進行GO生物功能學分析和KEGG pathway富集分析，分析結果見圖5a和圖5b。GO分析結果發(fā)現，這些靶點主要分布于內膜系統(tǒng)中，分子功能主要集中于蛋白結合、生物催化等功能上。通過參與生物體內細胞信號的傳導，細胞代謝和基因表達等過程，從而發(fā)揮出抗炎的作用[14]。KEGG pathway富集結果顯示，預測的靶點主要分布在信號傳導通路以及和癌癥相關的通路上。與信號傳導有關的通路有Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、RAS信號通路(Ras signaling pathway)鈣信號通路(Calcium signaling pathway)等，與癌癥相關的通路有乳腺癌(Breast cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、胃癌(Gastric cancer)等。

3 討論

本研究構建了西紅花有效成分-靶點-疾病的網絡，通過網絡分析得到了西紅花發(fā)揮抗炎作用的活性成分和靶點。其中與西紅花抗炎作用關系密切的化學成分有西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸，與抗炎作用關系密切的靶點有EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2，推測西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸通過作用于這些靶點，參與了生物體內MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、IL-17 signaling pathway等信號傳導過程，調節(jié)了血管通透性，影響了炎癥因子的釋放和表達，最終發(fā)揮了抗炎作用。

圖5a 預測靶點的GO富集結果Fig. 5a Predicted target GO enrichment results

圖5b 預測靶點的KEGG pathway富集結果Fig. 5b KEGG pathway enrichment results of predicted targets

表皮生長因子受體(EGFR)能與受體酪氨酸激酶(RTK)結合,當EGFR表達增強時，會促使上皮細胞生長因子與RTK形成復合物，影響上皮細胞增殖和分化，進而引起炎癥發(fā)生[15]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)能被多種炎癥因子激活，增加組織細胞炎癥發(fā)生機率，在炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的調控作用[16]。推測西紅花酸、異鼠李素和咖啡酸通過作用于EGFR、MAPK等靶點，減少了炎癥因子的產生和釋放，抑制了炎癥反應中關鍵蛋白的表達過程，從而發(fā)揮了抗炎作用[16]。動物試驗也表明，西紅花酸和異鼠李素可以有效抑制LPS誘導大鼠腫瘤壞死因子、IL-6、NO的釋放和NF-κB激活，具有顯著的抗炎和抗腫瘤作用[17]。這與本研究預測的結果基本一致，表明西紅花中抗炎成分通過相關靶點影響了生物的代謝信號傳導和相關酶的表達，從而發(fā)揮了抗炎和抗腫瘤作用[18]。