喻運(yùn)珍，余少梅，袁改玲，鄧平，張立強(qiáng)， 羅楊志，胡少迪,丁桂珍，程穎紅

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430207；2.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，武漢 430207；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，鯰形目、鲿科、黃顙魚屬魚類，在我國主要淡水水域中分布較廣，具有比較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前在我國已形成了較大的養(yǎng)殖規(guī)模[1]。但是隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高和養(yǎng)殖密度的不斷增大，黃顙魚病害逐漸增多，其中鯰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)引起的“裂頭病”或“紅頭病”危害最為嚴(yán)重，具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)[2]。鯰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)細(xì)菌，生產(chǎn)上主要通過抗生素藥物來治療[3]。但是抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的長期大量使用會(huì)導(dǎo)致很多問題，抗藥性、水產(chǎn)品藥物殘留、影響水體環(huán)境微生態(tài)平衡，抑制養(yǎng)殖動(dòng)物免疫系統(tǒng)等[4]。而中草藥具有無殘留、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，能夠提高機(jī)體免疫力、促生長、抗菌、抗病毒，用中草藥代替抗生素防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病是未來的發(fā)展方向[5]。新肝寶，通用名為肝膽利康散，由茵陳、大黃、郁金、連翹、柴胡等藥材粉碎加工而成，具有清肝利膽作用，主治魚類肝膽綜合征[6]。本研究旨在考察新肝寶預(yù)防用藥，能否提高黃顙魚抗鯰愛德華氏菌能力，同時(shí)比較了不同粉碎粒度(200目和600目)對(duì)藥效有何影響，為新肝寶在黃顙魚鯰愛德華氏菌病防控中的應(yīng)用提供相關(guān)數(shù)據(jù)參考。

1 材 料

1.1 材料和儀器 茵陳、大黃、郁金、連翹、柴胡、梔子、白芍、牡丹皮、藿香，均購自安徽旭松中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司質(zhì)檢部門按照《中華人民共和國獸藥典·2017年版中藥卷》[6]鑒定合格。新肝寶由以上藥材按比例粉碎混合而成，新肝寶200目由武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，新肝寶600目委托山東埃爾派粉體科技股份有限公司生產(chǎn)。

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，黃顙魚商品飼料購自武漢大北農(nóng)有限公司，溶菌酶、超氧化物歧化酶試劑盒購自南京建成研究所。

制料機(jī)購自九陽股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)，哈爾濱市冬聯(lián)公司；小型臺(tái)式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；高壓滅菌設(shè)備AMA240型，英國ASTELL公司；自動(dòng)制冰機(jī)，日本三洋公司。

1.2 試驗(yàn)魚 黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)購自湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司。選取健康黃顙魚280尾，體重25±5 g，暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院健康安全養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)大棚，每天換水1/3，控制水溫為26 ℃，暫養(yǎng)3天后馴食，每天上午11點(diǎn)和下午4點(diǎn)投喂一次基礎(chǔ)日糧，馴食一周后停食24 h開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 病原菌的培養(yǎng) 鯰愛德華氏菌由中國科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所提供，將菌劃線接種于BHI平板28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于BHI肉湯中，于28 ℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)菌的濃度備用。

1.4 試驗(yàn)飼料制備 試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)料和試驗(yàn)料。將新肝寶200目和600目粉末分別按0.1g /(kg魚)加入商品化基礎(chǔ)飼料粉末中，混勻后加入制料機(jī)，以適當(dāng)比例加水?dāng)嚢杈鶆?，將制備的濕料放暗處風(fēng)干，即得試驗(yàn)料。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將280尾魚隨機(jī)分為4個(gè)組，分別為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、新肝寶200目組、新肝寶600目組，每組兩個(gè)平行，每個(gè)平行35尾魚，每天換水1/3。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，新肝寶組投喂試驗(yàn)料，飼料每天按魚體重的2%進(jìn)行投喂，上午11點(diǎn)和下午4點(diǎn)各投喂一次。

投喂7d后停食24 h進(jìn)行人工感染，預(yù)試驗(yàn)確定鯰愛德華氏菌感染濃度為3×107CFU/mL(半致死濃度)。陰性對(duì)照組和新肝寶組每尾黃顙魚從腹鰭基部進(jìn)行腹腔注射100 μL菌液，正常對(duì)照組每尾腹腔注射100 μL生理鹽水，觀察各組黃顙魚死亡情況并記錄。分別在感染前和感染后5d取樣，每組取魚5尾，取血檢測血清指標(biāo)，解剖取肝、脾、腎做病理切片觀察組織學(xué)變化。

2.2 酶學(xué)指標(biāo)測定 從黃顙魚尾靜脈取血，37 ℃放置1 h，4 ℃過夜，3500 r/min離心10 min，吸取上清，-80 ℃冷凍備用，溶菌酶、超氧化物歧化酶采用南京建成試劑盒進(jìn)行測定。

2.3 組織病理觀察 分別取黃顙魚小塊肝臟、腎臟、脾臟組織，置于4%中性甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)洗滌、脫水、透明、滲透與包埋后，切成 5 μm 厚薄片，貼片后，用 HE 染色法進(jìn)行染色，再經(jīng)脫水和透明后用中性樹膠封片，400倍顯微鏡下觀察。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，所有數(shù)值均以“X±SD”表示，組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有顯著性時(shí)P<0.05，差異具有高度顯著性時(shí)P<0.01。

3 結(jié)果與分析

3.1 死亡率測定 如圖1所示，正常對(duì)照組從47 h開始出現(xiàn)黃顙魚死亡，5d共死魚3尾，最終的死亡率為4.3%；陰性對(duì)照組和新肝寶200目組經(jīng)鯰愛德華氏菌人工感染后5 h即開始出現(xiàn)死魚現(xiàn)象，新肝寶600目組25 h開始出現(xiàn)死魚，5 d陰性對(duì)照組總死亡率達(dá)54.29%，新肝寶200目和600目組總死亡率分別為48.57%和44.28%，小于陰性對(duì)照組。說明飼喂新肝寶能夠增強(qiáng)黃顙魚抗鯰愛德華氏菌的能力，降低死亡率，且600目作用效果好于200目。

圖1 不同處理組鯰愛德華氏菌感染后黃顙魚的死亡率Fig 1 Mortalities of yellow catfish infected with Edwardsiella ictaluri in different groups

3.2 血清中溶菌酶含量測定 由圖2可知，人工感染鯰愛德華氏菌前，各組間溶菌酶活性無顯著性差異(P>0.05)，感染后，各感染組溶菌酶活性均升高，新肝寶600目組溶菌酶活性>200目組>陰性對(duì)照組>正常對(duì)照組，組間差異顯著(P<0.05)。說明飼喂新肝寶可以提高感染愛德華氏菌后黃顙魚體內(nèi)溶菌酶活性，其中600目作用效果優(yōu)于200目。

注: 圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 Note: Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05).圖2 不同處理組黃顙魚血清溶菌酶活性變化情況Fig 2 The changes of LZM activities in serum of yellow catfish in different groups

3.3 血清中超氧化物歧化酶含量測定 由圖3可知，人工感染鯰愛德華氏菌前，新肝寶組超氧化物歧化酶活性顯著高于陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組(P<0.05)，感染后，新肝寶600目組超氧化物歧化酶活性>200目組>陰性對(duì)照組>正常對(duì)照組，組間差異顯著(P<0.05)。說明飼喂新肝寶可以顯著提高黃顙魚血液中超氧化物歧化酶活性，其中600目作用效果優(yōu)于200目。

注:圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05)圖3 不同處理組黃顙魚血清超氧化物 歧化酶活性變化情況Fig 3 The changes of SOD activities in serum of yellow catfish in different groups

3.4 病理切片觀察結(jié)果

3.4.1 肝臟組織 由圖4可知，正常對(duì)照組(a)肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，沿肝索排列整齊。陰性對(duì)照組(b)黃顙魚肝細(xì)胞界限模糊，肝索結(jié)構(gòu)不清晰，有炎癥細(xì)胞浸潤，還可以看到很多紅細(xì)胞，有充血或出血現(xiàn)象；新肝寶200目組(c)沒有清晰的中央靜脈，有少量炎性細(xì)胞，但肝細(xì)胞界限較清晰，肝索結(jié)構(gòu)明顯，呈放射狀；新肝寶600目組(d)肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列均勻規(guī)則，成放射狀圍繞中央靜脈排列。說明投喂新肝寶能夠減輕鯰愛德華氏菌感染引起的肝臟損傷，其中600目作用效果優(yōu)于200目。

3.4.2 腎臟組織 由圖5可知，正常對(duì)照組(a)黃顙魚腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞未見脫落、腫脹。陰性對(duì)照組(b)腎臟組織中細(xì)胞界限模糊，腎小管上皮細(xì)胞有壞死、脫落現(xiàn)象，出現(xiàn)空泡化變性，有大量炎性細(xì)胞浸潤。新肝寶組(c、d)腎小管和腎小體結(jié)構(gòu)清晰，部分腎小管上皮細(xì)胞有壞死、脫落現(xiàn)象，有紅細(xì)胞充血現(xiàn)象，其中200目組(c)有炎癥細(xì)胞浸潤。說明新肝寶能夠減輕鯰愛德華氏菌感染引起的腎臟損傷，其中600目作用效果略好于200目。

圖4 不同處理組黃顙魚肝臟病理切片圖(×400)Fig 4 Pathological sections of liver of yellow catfish in different groups (×400)

圖5 不同處理組黃顙魚腎臟病理切片圖(×400)Fig 5 Pathological sections of kidney of yellow catfish in different groups (×400)

3.4.3 脾臟組織 由圖6可知，正常對(duì)照組(a)黃顙魚脾小葉結(jié)構(gòu)清晰，脾臟紅髓白髓分界清晰，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集，紅髓內(nèi)彌漫脾血竇，脾小梁形態(tài)完整。陰性對(duì)照組(b)黃顙魚脾小葉結(jié)構(gòu)不清晰，結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤。新肝寶組(c，d)紅細(xì)胞數(shù)目增多，有充血和出血現(xiàn)象，其中600目組(d)脾小葉結(jié)構(gòu)清晰，脾竇和脾索均可見。說明新肝寶能夠減輕鯰愛德華氏菌造成的脾臟組織損傷，其中600目作用效果優(yōu)于200目。

圖6 不同處理組黃顙魚脾臟病理切片圖(×400)Fig 6 Pathological sections of spleen of yellow catfish in different groups (×400)

4 討論與結(jié)論

杜宗君等[3]研究發(fā)現(xiàn)鯰愛德華氏菌感染黃顙魚后，以肝、脾、腎的損傷出現(xiàn)最早、最嚴(yán)重，是其損傷主要的靶器官，感染魚最終因多組織、器官結(jié)構(gòu)破壞，引起魚體多器官功能衰竭而死亡。研究中黃顙魚人工感染鯰愛德華氏菌5 d后，感染組黃顙魚肝臟、腎臟、脾臟均分別出現(xiàn)不同程度的病變，其中新肝寶組黃顙魚損傷程度明顯小于陰性對(duì)照組，表明新肝寶對(duì)鯰愛德華氏菌造成的黃顙魚肝、脾、腎損傷有一定的保護(hù)作用。同時(shí)，溶菌酶是一種水解酶，存在于許多魚類體表粘液、腸道粘液、血清及巨噬細(xì)胞中，具有抗菌抗病毒的功能，是魚類非特異性免疫的重要組成部分[7]。超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受損傷，是一種重要的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用[8]。飼喂新肝寶的黃顙魚血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶活性顯著高于陰性對(duì)照組，說明新肝寶能夠提高黃顙魚非特異性免疫能力。

新肝寶各藥材成分中，茵陳中杜薛花酸、阿魏巧等有抑菌作用；大黃中大黃素具有抑菌、抗炎作用；連翹對(duì)多種革蘭氏陰性菌、陽性菌、結(jié)核桿菌、真菌等有抑制作用；藿香及其提取物對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物，均具有明顯的抑制、滅殺作用；同時(shí)茵陳、大黃、郁金、連翹、柴胡、梔子、白芍、牡丹皮均有抗氧化、保肝利膽的作用[9-17]。因此，在新肝寶各組成藥物的在抗菌和保肝功效的共同作用下，可以減輕鯰愛德華氏菌對(duì)黃顙魚機(jī)體造成的損傷。

研究表明，茵陳有效成分咖啡酸可增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御體系；大黃素、大黃多糖對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有雙向調(diào)節(jié)功能；連翹苷可調(diào)節(jié)免疫功能，并有一定抗應(yīng)激能力；藿香中百秋李醇具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用；牡丹皮中丹皮酚具有增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫的作用[9,10,11,12,17]。在這幾種藥物有效成分的共同作用下，起到調(diào)節(jié)黃顙魚免疫力的作用。新肝寶中9種藥材，相輔相成，共同發(fā)揮提高免疫力、抗菌、保肝的作用，因此，新肝寶能夠提高黃顙魚非特異性免疫力，增強(qiáng)黃顙魚對(duì)鯰愛德華氏菌的抵抗能力，在一定程度上減輕鯰愛德華氏菌感染導(dǎo)致的肝、腎、脾損傷，故新肝寶可以在黃顙魚鯰愛德華氏菌病流行期作為預(yù)防輔助用藥。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)新肝寶600目超微粉作用效果優(yōu)于200目極細(xì)粉[18]。中草藥中有效成分一般需經(jīng)過浸潤、溶脹、滲透、分散才能溶出，采用超微粉碎工藝，細(xì)胞破壁率達(dá)95%以上，消除細(xì)胞壁阻力，能夠加快溶出速率和溶出量，與傳統(tǒng)粉散劑比較，具有有效成分釋放快、生物利用率高以及臨床作用效果顯著等特點(diǎn)[19-20]。因此，新肝寶臨床應(yīng)用優(yōu)先選擇600目超微粉。

綜上所述，新肝寶可以在黃顙魚鯰愛德華氏菌病流行期作為預(yù)防輔助用藥，且優(yōu)選先用超微粉。