賴(lài)鑫，陳智華，范希萍，常麗燁，韓鵬，梁倩，史冬雪，年聚盆，亢心

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)被認(rèn)為是最有效的骨誘導(dǎo)分化因子，可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的分化為骨和軟骨細(xì)胞[1-2]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)被證實(shí)具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂的作用[3-4]。有研究表明，妥布霉素應(yīng)用于骨折局部不僅可以預(yù)防感染還可以促進(jìn)骨折修復(fù)[5]。如果將rhBMP-2、bFGF和妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用于骨折愈合理論上能起到比單獨(dú)應(yīng)用更好的效果。但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。另外，rhBMP-2、bFGF和妥布霉素如果直接應(yīng)用于骨折部，很快就會(huì)被組織吸收，若長(zhǎng)期注射抗生素，會(huì)加大抗生素的毒副作用也會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。故需要一種緩釋載體來(lái)承載這些藥物，以達(dá)到在骨折部位緩慢而持久的釋放高濃度藥物的目的。膠原纖維蛋白(FG)是一種已經(jīng)被成熟應(yīng)用的骨組織工程支架。有低抗原性、優(yōu)秀的生物相容性等特點(diǎn)，其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以有助于新生細(xì)胞的附著還可以減緩藥物釋放的速度。因此，本研究將rhBMP-2、bFGF和妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用，以FG為緩釋載體應(yīng)用在骨折部，觀察它對(duì)骨折愈合過(guò)程的影響，探索新的犬的骨折治療思路。

1 材 料

1.1 動(dòng)物及分組 市場(chǎng)采購(gòu)成年已進(jìn)行過(guò)免疫及驅(qū)蟲(chóng)、體況良好的小型犬12只，雌雄不限。所有犬均建立脛骨骨折模型，右側(cè)肢脛骨骨折模型作為對(duì)照組，骨折處不用任何藥物；左側(cè)肢脛骨骨折模型作為實(shí)驗(yàn)組，骨折處應(yīng)用FG/rhBMP-2/bFGF/妥布霉素復(fù)合物。

2.2 儀器及藥品 常規(guī)軟組織器械包；骨科器械包；動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)(型號(hào)：Model3000)：美國(guó)MATRX公司；數(shù)字化醫(yī)用X射線(xiàn)攝影系統(tǒng)(型號(hào)：Ange11-DR-A-H)：深圳市安健科技有限公司；獸用監(jiān)護(hù)儀(型號(hào)：ipm12 Vet)：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；手術(shù)無(wú)影燈(型號(hào)：ZF700)：山東銘泰醫(yī)療器械有限公司；注射用氨芐西林鈉：河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，獸藥字(2013)030011304；多咪靜：碩騰動(dòng)物保健用品有限公司，外獸藥證字52號(hào)；異氟烷：魯南貝特制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020267；豬纖維蛋白原(純度>85%)：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院外科教研組實(shí)驗(yàn)室提取；矛頭蝮蛇凝血酶：深圳市康初源有限公司；氯化鈣：連云港樂(lè)天化工有限公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子：賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；硫酸妥布霉素注射液：上海禾豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022032

2 方 法

2.1 FG/rhBMP-2/bFGF/妥布霉素復(fù)合物的配制 手術(shù)開(kāi)始前15 min，在嚴(yán)格無(wú)菌的的條件下制備纖維蛋白膠A液和B液。A液的配置：37℃水浴加熱條件下將100 mg纖維蛋白原和0.8 mL妥布霉素注射液混合，輕搖震蕩使兩種藥均勻混合；B液：將800 mg人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、3.5 mg氯化鈣、3 mg凝血酶原和0.016 mg堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶解于0.8 mL妥布霉素注射液，混合后輕搖使其完全溶解。放置于雙聯(lián)注射器支架內(nèi)，待用。

2.2 犬脛骨骨折模型的構(gòu)建

2.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備、用藥與麻醉 術(shù)前禁食禁水12 h，術(shù)前15 min肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)、尖吻蝮蛇凝血酶(10 UI/kg)。肌肉注射多咪靜(500 μg/kg)進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，動(dòng)物進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，插入氣管插管并連接動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)使用異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉。連接監(jiān)護(hù)儀隨時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物生命體征。備皮、仰臥保定、后肢懸吊、隔離、消毒。

2.2.2 手術(shù)過(guò)程 做切口，近端于脛骨內(nèi)側(cè)髁開(kāi)始，向前弧形至脛骨干中線(xiàn)，并沿其中線(xiàn)繼續(xù)向下切開(kāi)，然后再弧形終止至脛骨內(nèi)髁。依皮膚切口線(xiàn)切開(kāi)皮下組織。切開(kāi)筋膜顯露脛骨，再分離筋膜顯露諸肌肉。手術(shù)設(shè)計(jì)為先在脛骨上固定一塊長(zhǎng)度為脛骨3/2寬度與脛骨體相當(dāng)?shù)墓前逶黉彅嗝劰堑姆椒▉?lái)建立脛骨骨折模型。為使接骨板與脛骨體緊密結(jié)合，用骨板彎折器給接骨板塑性，用導(dǎo)孔復(fù)位鉗固定脛骨體和接骨板方便打孔，通過(guò)接骨板導(dǎo)孔在預(yù)定鋸斷脛骨位置的遠(yuǎn)端和近端各打兩個(gè)直徑1.5 mm的孔，并植入骨螺釘，用電動(dòng)平擺鋸在接骨板橋接部位中心點(diǎn)垂直于脛骨將脛骨鋸斷(鋸片寬7 mm、厚0.7 mm)，由助手持雙聯(lián)注射器將藥物緩慢填滿(mǎn)骨折處，對(duì)照組則不使用任何藥物。逐層縫合骨膜、肌肉、皮膚。手術(shù)全程在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行。

2.2.3 術(shù)后護(hù)理 安靜飼養(yǎng)，使用氨芐西林鈉(15 mg/kg)靜脈滴注連用三天，做輔助全身抗感染治療。因?yàn)槿畠珊笾荒苓\(yùn)動(dòng)，故制作改良托馬斯支架輔助支撐，同時(shí)每天人為輔助運(yùn)動(dòng)后肢，防止肌肉萎縮。

2.3 術(shù)后骨折部周?chē)浗M織充血水腫消失時(shí)間測(cè)定 每日拆開(kāi)托馬斯支架采用觸診和視診的方法，測(cè)定術(shù)后骨折部周?chē)浗M織充血水腫消失時(shí)間。

2.4 X射線(xiàn)影像學(xué)觀察 術(shù)后借助X射線(xiàn)觀察骨折部的變化。參考唐琳麗[6]對(duì)X射線(xiàn)閱片評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表1)，以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)術(shù)后骨折部骨愈合程度進(jìn)行評(píng)分。

2.5 骨密度(BMD)及骨密度比率測(cè)定 根據(jù)Kenae[7]的研究可知，密度為130 mg/cm2的骨礦物質(zhì)等同于厚度為1 mm的鋁。故將一塊標(biāo)準(zhǔn)的梯形鋁楔(高16.0 mm、上底1.0 mm、下底18.0 mm)與骨折部放置于同一X射線(xiàn)曝光位置下進(jìn)行拍攝。取與骨折部位灰度相同的鋁楔的厚度，即可測(cè)出該部位的骨密度(BMD)。骨密度比率=新生骨骨密度/健康骨骨密度。

2.6 骨痂體積測(cè)定 術(shù)后第4周和第8周，隨機(jī)抽取兩只實(shí)驗(yàn)犬，手術(shù)暴露骨折部位，測(cè)量骨痂長(zhǎng)度(L)骨痂半徑(R2)和脛骨半徑(R1)。參考Perkins[7]骨痂體積計(jì)算公式：2πR1(R2-R1)L,計(jì)算出骨痂體積。

2.7 骨生物力學(xué)強(qiáng)度測(cè)定 術(shù)后第16周采用丙泊酚靜脈注射麻醉后靜脈注射氯化鉀的方法將動(dòng)物安樂(lè)死，截取兩側(cè)脛骨，除去骨板及覆蓋在脛骨表面的軟組織。使用微機(jī)控制電子萬(wàn)能(拉力)實(shí)驗(yàn)機(jī)，對(duì)脛骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲破壞實(shí)驗(yàn)。跨距56 mm對(duì)脛骨的載荷為2.00 mm/min，直到脛骨折斷，記錄脛骨折斷時(shí)脛骨彎曲的位移和脛骨承受的拉力。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0完成。數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 術(shù)后骨折部周?chē)浗M織充血水腫消失時(shí)間

表2 術(shù)后骨折部周?chē)浗M織充血水腫消失時(shí)間Tab 2 Time of disappearance of congestion and edema of soft tissue around fracture after operation

*表示組內(nèi)比較，#表示與對(duì)照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

由表2可知，術(shù)后術(shù)部軟組織紅，腫，熱消失時(shí)間實(shí)驗(yàn)組明顯短于對(duì)照組。

3.2 X光影像學(xué)綜合評(píng)分結(jié)果 由表3可知，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組第2周、4周、8周、12周影像學(xué)評(píng)分結(jié)果均顯著高于對(duì)照組(p>0.01)。第16周影像學(xué)評(píng)分實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組但差異不顯著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后16周與術(shù)后12周相比，差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明術(shù)后12周骨骼已基本愈合。

表3 X光影像學(xué)評(píng)分結(jié)果Tab 3 X-ray imaging score results

*表示組內(nèi)比較，#表示與對(duì)照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

圖1 術(shù)后第2周Fig 1 2ndweek after operation

圖2 術(shù)后第4周Fig 2 4ndweek after operation

圖3 術(shù)后第6周Fig 3 6ndweek after operation

圖4 術(shù)后第8周Fig 4 8ndweek after operation

圖5 術(shù)后第12周Fig 5 12ndweek after operation

3.3 BMD及BMD比率測(cè)定結(jié)果 由表4可知，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組第2周、4周、8周、12周影像學(xué)評(píng)分結(jié)果均顯著高于對(duì)照組(p>0.01)。第16W影像學(xué)評(píng)分實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組但差異不顯著(P>0.05)。

3.4 骨痂體積 由表5可知，術(shù)后4周和術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組骨痂體積均大于對(duì)照組。

3.5 骨生物力學(xué)強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果 由表6可知，術(shù)后16周，實(shí)驗(yàn)組脛骨可以承受的最大位移和最大載荷均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BMD及BMD比率Tab 4 BMD and BMD ratio at different time points after operation

*表示組內(nèi)比較，#表示與對(duì)照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

表5 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)骨痂體積測(cè)量結(jié)果Tab 5 Measurement results of mineralization volume at different time points after operation

*表示組內(nèi)比較，#表示與對(duì)照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

表6 術(shù)后16周脛骨生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果Tab 6 Measurement test results of tibia at 16th weeks after operation

*表示組內(nèi)比較，#表示與對(duì)照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

4 討論與結(jié)論

4.1 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對(duì)X射線(xiàn)評(píng)分的影響 骨折愈合最初兩周，是內(nèi)外骨痂和橋梁骨痂形成、以及相互融合后形成原始骨痂的過(guò)程。觀察術(shù)后第2周X光片發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組骨折斷端較清晰，骨折線(xiàn)開(kāi)始模糊，可見(jiàn)少量骨痂但邊緣不整齊X射線(xiàn)評(píng)分為10.00分，對(duì)照組骨折斷端清晰，邊緣模糊，幾乎看不見(jiàn)骨痂生長(zhǎng)X射線(xiàn)評(píng)分為6.00分。因?yàn)閮?nèi)骨痂、橋梁骨痂由于骨皮質(zhì)的重疊及骨化慢所以X光片上不易顯影[8]。在X光片上可見(jiàn)密度比骨皮質(zhì)低的梭形骨痂陰影(外骨痂)。因此，實(shí)驗(yàn)組犬脛骨較對(duì)照組更早開(kāi)始骨折的修復(fù)。

BMP作為骨折修復(fù)中骨生成的啟動(dòng)因子，在骨折愈合前期起主要作用。BMP-2可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨細(xì)胞，同時(shí)有研究表明[9]，BMP-2同時(shí)也可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞等向骨細(xì)胞分化[10]。bFGF有促進(jìn)由間質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的骨細(xì)胞增殖的作用[11]。也可促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中建立良好的血運(yùn)[12-13]，而有的研究認(rèn)為[14]，在一些骨不連接的組織中的成骨細(xì)胞其實(shí)和正常成骨細(xì)胞在功能上是一致的。因此，在術(shù)后第4周和第8周實(shí)驗(yàn)組X光影像評(píng)分都顯著高于對(duì)照組，且從X光片上可得知，實(shí)驗(yàn)組在第8周骨皮質(zhì)連接骨折線(xiàn)就已基本消，而對(duì)照組一直到第12周才達(dá)到相同的效果。實(shí)驗(yàn)組能夠比對(duì)照組更快的使骨折愈合，是因?yàn)镕G聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素形成的網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，可使rhBMP-2、bFGF緩慢的作用于骨折部位，加快骨細(xì)胞分化，促進(jìn)新血管生成。

4.3 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對(duì)骨痂體積的影響 骨痂體積可以作為骨折愈合程度的輔助方法之一，骨痂生成的多證明骨折愈合速度較快，骨痂生成的少證明骨折愈合的速度較慢[15]。本研究表明，術(shù)后第4周和第8周測(cè)量骨痂體積實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組大。因?yàn)镕G聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素應(yīng)用于骨折部位，包裹住受傷組織可以減小血腫擴(kuò)大，所以骨折能盡快以膜內(nèi)成骨的方式達(dá)到愈合。妥布霉素作為一種抗生素可以有效抑制感染。bFGF可以促進(jìn)血管生成，細(xì)胞遷移及增殖。巨噬細(xì)胞具有吞噬運(yùn)輸壞死物質(zhì)的功能，在骨折愈合初期有重要的作用，而FG可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向骨折部位遷移[16]。FG聯(lián)合妥布霉素、rhBMP-2與bFGF在骨愈合時(shí)期促進(jìn)骨折部位周?chē)M織建立了更好的血液供應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)了纖維性骨痂中膠原纖維的生成。當(dāng)在X光片上看不到骨痂間隙，骨痂與骨皮質(zhì)界限分不清楚時(shí)，骨折已達(dá)到骨性愈合，這時(shí)骨痂中的破骨細(xì)胞開(kāi)始清除不需要的骨組織，同時(shí)在骨痂不足的部位成骨細(xì)胞產(chǎn)生新骨[17]。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組在術(shù)后8周的骨痂體積都小于第4周，說(shuō)明骨折在第8周已經(jīng)進(jìn)入骨痂重塑期。

4.4 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對(duì)BMD和骨生物力學(xué)強(qiáng)度的影響 骨折后形成的原始骨痂非常脆弱，只能起到暫時(shí)固定的作用，要形成堅(jiān)固的成熟骨形態(tài)，需要通過(guò)骨改建的過(guò)程，術(shù)后第16周測(cè)定不論是骨生物力學(xué)強(qiáng)度還是BMD實(shí)驗(yàn)組都明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組骨折部更堅(jiān)固。新生成的骨鈣化是一個(gè)重要的過(guò)程，良好的血運(yùn)可以運(yùn)輸充足的Ca+和血P+到達(dá)骨折部。bFGF可以促進(jìn)血管生成建立良好的血液供應(yīng)[18]。骨膠原纖維與膠原纖維都是由Ⅰ型膠原蛋白組成的，但是骨膠原蛋白的化學(xué)鍵不同，骨膠原蛋白有更好的穩(wěn)定性，是沉積鈣鹽的重要結(jié)構(gòu)[19]。bFGF同時(shí)還能促進(jìn)APL(堿性磷酸酶)的釋放，APL是骨骼愈合中非常重要的一種酶可以使骨折部無(wú)機(jī)磷的濃度升高，對(duì)新生成骨礦物質(zhì)沉積有促進(jìn)作用[20]。所以FG聯(lián)合妥布霉素、rhBMP-2與bFGF促進(jìn)建立良好的血液循環(huán)網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)ALP釋放是術(shù)后實(shí)驗(yàn)組BMD高于對(duì)照組的原因[21-22]。

4.5 結(jié)論 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素，可加快骨折愈合的速度，縮短骨折愈合的時(shí)間，可促使骨折愈合過(guò)程中骨痂的形成，促使骨折愈合過(guò)程中骨礦物質(zhì)的沉積和骨折愈合后生物力學(xué)強(qiáng)度的恢復(fù)，對(duì)骨折術(shù)部軟組織愈合也具有一定的促進(jìn)作用。四種材料相輔相成，參與骨折愈合的全過(guò)程，具有良好的促進(jìn)骨折愈合效果，為犬骨折臨床治療提供了一個(gè)新方案。