趙藝涵1，賴(lài)潤(rùn)民1，史大卓，張 瑩

動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心腦血管疾病是我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)位居前列的死亡原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化早期無(wú)癥狀，但隨著病變逐步進(jìn)展斑塊可堵塞管腔，甚至破裂形成血栓，進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重臨床事件的發(fā)生，如急性心肌梗死或腦卒中。動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化十分復(fù)雜[2]，在動(dòng)脈粥樣硬化早期，富含膽固醇的低密度脂蛋白-膽固醇沉積于血管壁并被氧化修飾，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)黏附分子，使巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞于病變處聚集。巨噬細(xì)胞吞噬氧化脂質(zhì)后形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞死亡裂解后形成纖維帽。晚期不穩(wěn)定斑塊破裂后形成血栓阻塞管腔。

中醫(yī)學(xué)將動(dòng)脈粥樣硬化的病因病機(jī)歸于“血脈瘀阻”的范疇，但經(jīng)多年的臨床實(shí)踐與觀(guān)察發(fā)現(xiàn)血瘀病因不能全面概括心血管疾病發(fā)生發(fā)展出現(xiàn)的組織壞死、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等改變，因此，陳可冀院士提出了“毒邪致病”的學(xué)說(shuō)。在此理論指導(dǎo)下，已有基礎(chǔ)研究證明活血解毒中藥有效成分具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抑制炎癥等作用[3-4]，在臨床上也形成了行之有效的活血、化瘀、解毒治則治法?；钛鏊幋ㄜ号c清熱解毒藥黃連聯(lián)用是常見(jiàn)的活血解毒藥對(duì)，基礎(chǔ)研究已證實(shí)單用川芎或黃連活性成分具有明確的抗動(dòng)脈粥樣硬化效果[5-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理是采用“網(wǎng)狀目標(biāo)、多組分、多通路”的新模式來(lái)探究中藥可能靶點(diǎn)的方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體出發(fā)，采用生物信息學(xué)手段構(gòu)建不同層次的節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從而在分子層面系統(tǒng)性預(yù)測(cè)中藥及復(fù)方活性成分和作用靶點(diǎn)[9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出川芎、黃連中的活性成分，進(jìn)一步發(fā)掘其改善動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)，可為闡釋川芎-黃連藥對(duì)改善動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 黃連、川芎活性成分的收集與篩選 利用TCMSP平臺(tái)收集川芎及黃連的所有化學(xué)成分，篩選出藥物相似性(drug likeness，DL)>0.18[10]、口服生物利用度(oral bioavailablitity，OB)>30%[11]的化學(xué)成分作為候選藥物成分。并根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充以下川芎活性成分[5-6，12-15 ]：Tetramethylpyrazine，Ligustilide，Senkyunolide A，Senkyunolide G，Butylphthalide，F(xiàn)erulic acid。進(jìn)一步利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的活性分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)辨別，確定2D、3D結(jié)構(gòu)及簡(jiǎn)化分子線(xiàn)性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry specification，SMILES)。

1.2 川芎-黃連作用靶點(diǎn)的收集與預(yù)測(cè) Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)[16]可基于待測(cè)分子的2D及3D結(jié)構(gòu)與已知配體的相似度，通過(guò)交叉驗(yàn)證和分析排列從而預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。將經(jīng)1.1篩選得到的黃連-川芎藥對(duì)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入SwissTarget數(shù)據(jù)庫(kù)，限定研究物種為人(homo sapiens)查找靶點(diǎn)，使靶點(diǎn)蛋白質(zhì)名稱(chēng)、靶點(diǎn)基因名稱(chēng)與Uniprot ID一一對(duì)應(yīng)。利用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.7.0構(gòu)建川芎-黃連藥對(duì)的活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因靶點(diǎn)，導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)名稱(chēng)-ID配對(duì)獲得相關(guān)基因靶點(diǎn)的UniProt ID，并在Cytoscape中構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化的疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將川芎-黃連藥對(duì)的主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape中取交集，從而獲得藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.5 相關(guān)靶點(diǎn)基因分析與通路分析 利用FunRich軟件[17]對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO(gene ontology)生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能的富集分析，使用Cytoscape的Clue Go插件[18]進(jìn)行KEGG通路分析，并對(duì)P值進(jìn)行校正，設(shè)定P<0.05，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 川芎-黃連活性成分和作用靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OB及DL篩選，并且與PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照確定分子式，共得到27種候選藥物成分，其中13種成分來(lái)源于川芎，14種來(lái)源于黃連。利用Swiss Target查找此27個(gè)主要活性成分可能的作用靶點(diǎn)，將27個(gè)主要活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape中，獲得主要活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。詳見(jiàn)表1。

表1 川芎-黃連藥對(duì)的27種活性成分

(續(xù)表)

TCMSP編號(hào) 活性成分OB(%)DL來(lái)源PubChem CIDMOL002157Wallichilide42.310.71川芎10873344MOL002151Senkyunone47.660.24川芎91726743MOL002140Perlolyrine65.950.27川芎160179MOL002122Z-Ligustilide53.720.07川芎5319022MOL0021814-hydroxy-3-butylphthalide70.310.08川芎11074544MOL002208Senkyunolide A26.560.07川芎3085257MOL002202Tetramethylpyrazine20.010.03川芎14296MOL002209Senkyunolide G39.520.08川芎10013283MOL001454Berberine36.860.78黃連2353MOL002903(R)-Canadine55.370.77黃連443422MOL002894Berberrubine35.740.73黃連72704MOL002904Berlambine36.680.82黃連11066MOL001458Coptisine30.670.86黃連72322MOL002907Corchoroside A aglycon104.950.78黃連6185MOL002897Epiberberine43.090.78黃連160876MOL008647Moupinamide86.710.26黃連5280537MOL013352Obacunone43.290.77黃連119041MOL000622Magnograndiolide63.710.19黃連5319198MOL000785Palmatine64.600.65黃連19009MOL000762Palmidin A35.360.65黃連5320384MOL000098Quercetin46.430.28黃連5280343MOL002668Worenine45.830.87黃連20055073

2.2 川芎-黃連改善動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)篩選 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因3 152個(gè)，將基因名稱(chēng)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)名稱(chēng)Uniprot ID配對(duì)后獲得相關(guān)ID 3 121個(gè)，導(dǎo)入Cytoscape中，建立疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將主要活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及疾病-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)取交集，得到川芎-黃連改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)170個(gè)。將靶點(diǎn)名稱(chēng)及相應(yīng)的度值導(dǎo)出，并據(jù)度值大小按降序，排序?qū)⑶?0位繪制成表格。詳見(jiàn)表2。

表2 川芎-黃連改善動(dòng)脈粥樣硬化潛在作用靶點(diǎn)(前50位)

(續(xù)表)

Uniprot IDGeneCards度值Uniprot IDGeneCards度值Q99720SIGMAR15P35372OPRM12P41595HTR2B5P07451CA32P28335HTR2C5O43570CA122P23975SLC6A25P08908HTR1A2P51589CYP2J24P34972CNR22O15296ALOX15B4P21554CNR12

2.3 川芎-黃連活性成分-動(dòng)脈粥樣硬化-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 將Cytoscape中得到的藥物活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)出，川芎-黃連藥對(duì)中的27個(gè)主要活性成分與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因中的170個(gè)基因之間存在397條關(guān)聯(lián)。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析可知藥物-活性成分-疾病-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括197個(gè)節(jié)點(diǎn)，397條邊，橙色節(jié)點(diǎn)代表黃連活性成分，紅色節(jié)點(diǎn)代表川芎活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)基因。節(jié)點(diǎn)圖標(biāo)大小與節(jié)點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的度的大小成正比，圖中節(jié)點(diǎn)越大則表示該節(jié)點(diǎn)的度越大，可能在網(wǎng)絡(luò)中起著樞紐作用。據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知1個(gè)活性成分可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，1個(gè)靶點(diǎn)也可以與多個(gè)活性成分發(fā)生作用；納入網(wǎng)絡(luò)分析的所有活性成分的度值≥8，而度的數(shù)值位于前列的靶點(diǎn)基因則有MBNL1、BCHE、ACHE、CHRM1、CHRM4、MBNL3、MBNL2。詳見(jiàn)圖1。

圖1川芎-黃連活性成分-動(dòng)脈粥樣硬化-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路富集分析 利用Funrich軟件進(jìn)行Go分析，選取P<0.05且與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，按照P值升序排序整理成圖2。詳見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示相關(guān)生物學(xué)過(guò)程主要涉及G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、脂氧合酶途徑、多不飽和脂肪酸生物合成途徑、氧化還原進(jìn)程等。利用Cytoscape的Clue Go插件進(jìn)行KEGG通路分析，選取P<0.05的結(jié)果，通過(guò)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中查找信號(hào)通路信息獲得與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的通路16條整理成表，并按照相關(guān)生物過(guò)程簡(jiǎn)單分為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及排泄系統(tǒng)4大類(lèi)。其中富集程度高且富集基因數(shù)量較多的通路主要集中于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，包括神經(jīng)配體-受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路等。詳見(jiàn)表3。

圖2 川芎-黃連藥對(duì)改善動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)進(jìn)程

3 討 論

迄今為止，動(dòng)脈粥樣硬化的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但公認(rèn)的危險(xiǎn)因素包括血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖和代謝綜合征等[19]?；钛舛舅帉?duì)川芎-黃連配伍基于陳可冀院士“活血解毒”治療心血管疾病的基本思路，屬于協(xié)同增效的現(xiàn)代藥對(duì)。通過(guò)構(gòu)建川芎-黃連藥對(duì)改善動(dòng)脈粥樣硬化的藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)27個(gè)活性成分可作用于170個(gè)靶點(diǎn)基因，證實(shí)中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的機(jī)制。GO分析顯示生物學(xué)過(guò)程主要包括G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、脂氧合酶途徑、多不飽和脂肪酸生物合成途徑、氧化還原進(jìn)程等，KEGG分析涉及的信號(hào)通路則與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)與排泄系統(tǒng)4類(lèi)過(guò)程相關(guān)，因此，川芎-黃連藥對(duì)有著通過(guò)上述機(jī)制改善動(dòng)脈粥樣硬化的可能性。

就動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程而言，炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程始終，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。MAPK信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控與動(dòng)脈粥樣硬化早期炎癥反應(yīng)，對(duì)于血小板活化過(guò)程也有著影響?；A(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)p38MAPK通路與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[20]。黃連有效成分及川芎有效成分分別通過(guò)MAPK信號(hào)通路減小斑塊面積以提升斑塊穩(wěn)定性均已有研究報(bào)道[5，7]，這與本KEGG分析結(jié)果顯示川芎-黃連藥對(duì)通過(guò)MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的結(jié)果有著一致性。血栓形成是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展惡化的重要過(guò)程之一，90%的急性冠脈綜合征來(lái)源于斑塊破裂后的血栓形成[19]。血小板的活化及后續(xù)炎癥反應(yīng)則離不開(kāi)血小板自身存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，其中嘌呤能受體P2Y12及P2Y1在血小板活化和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，具體機(jī)制為二磷酸腺苷(ADP)與血小板膜上的ADP受體P2Y1或P2Y12結(jié)合，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生血小板活化作用。P2Y1與Gq蛋白結(jié)合，激活下游的磷脂酶C，促進(jìn)胞漿內(nèi)鈣離子釋放，引起血小板聚集。P2Y12偶聯(lián)G蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低cAMP含量，激活下游PIK3/Akt蛋白通路從而引起纖維蛋白原受體激活及擴(kuò)增血小板聚集反應(yīng)[21-22]?，F(xiàn)有ADP受體/P2Y12抑制劑如氯吡格雷、替格瑞洛已廣泛應(yīng)用于臨床。據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知鈣離子信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路可能是川芎-黃連改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)通路，而生物學(xué)進(jìn)程則包括G蛋白受體偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這與既往川芎與黃連的有效成分聯(lián)用可抑制急性心肌梗死大鼠模型ADP誘導(dǎo)的血小板聚集[23]的報(bào)道相一致，為川芎-黃連這一現(xiàn)代活血解毒藥對(duì)改善動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制提供了新的思路。

糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素之一，急性冠狀動(dòng)脈事件在糖尿病病人中的發(fā)生概率是正常人的3～5倍[19]。據(jù)KEGG分析可知川芎-黃連可能有著調(diào)節(jié)胰島素分泌、減輕胰島素抵抗的作用。黃連素對(duì)于糖尿病和胰島素抵抗大鼠有提升糖耐量、升高胰島素、降低三酰甘油作用[24]。高血壓可損傷血管內(nèi)膜，增加血管壁對(duì)脂蛋白的通透性及造成血流動(dòng)力學(xué)異常，加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[19]。醛固酮可進(jìn)行鈉離子及水分的重吸收從而調(diào)節(jié)血容量，在血壓調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)有報(bào)道顯示川芎有效成分或黃連有效成分單用可降低血漿醛固酮水平、調(diào)節(jié)血壓、抑制心肌纖維化進(jìn)程[25-26]。由KEGG分析結(jié)果可知川芎-黃連可能有干預(yù)醛固酮調(diào)節(jié)的鈉離子重吸收、調(diào)節(jié)醛固酮合成與分泌的作用，從而控制血壓、改善動(dòng)脈粥樣硬化。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡釋了川芎-黃連改善動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制，為后續(xù)研究提供了新思路，但仍需進(jìn)一步從動(dòng)物或細(xì)胞水平驗(yàn)證才能揭示其防治疾病的作用機(jī)制。