胡寶翠,郝金奇,施瑞清,侯瑞麗,余艷琴,張 冬,鄧樂樂,韋麗琴

0 引 言

抗結(jié)核藥物致肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced hepatic injury, ADIH)是結(jié)核病患者在進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療時的不良反應(yīng)之一，其發(fā)生率在2.5%～34.9%[1-3]，不同國家和民族有所不同?？菇Y(jié)核藥物主要是在肝中經(jīng)藥物代謝酶作用進(jìn)行代謝，參與該代謝過程的藥物代謝酶主要有Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶。與ADIH發(fā)生相關(guān)的Ⅰ相藥物代謝酶主要有CYP450酶系，Ⅱ相藥物代謝酶主要有NATs酶系和GSTs酶系[4-5]。有研究者發(fā)現(xiàn)NAT2慢乙酰化基因型是ADIH發(fā)生的危險因素[6]。除此之外，遺傳因素中的表觀遺傳學(xué)也在ADIH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。有研究表明，細(xì)胞色素P450 1A1基因CpG島甲基化與ADIH的發(fā)生相關(guān)，其調(diào)整OR值和95%CI分別為2.090和1.107～3.946 (P=0.023)[8]。動物實(shí)驗表明，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1、細(xì)胞色素P450 1A1和1B1啟動子區(qū)CpG島甲基化對異煙肼誘導(dǎo)的大鼠肝損傷有調(diào)控作用[9-10]。

CYP2E1基因控制表達(dá)的酶是CYP450酶系的一種重要藥物代謝酶。CYP2E1酶活性受基因位點(diǎn)的多態(tài)性調(diào)控，其中CYP2E1 rs2031920野生型等位基因(C1)的第1053位核苷酸存在一個RsaI酶識別部位，而突變型等位基因(C2)在該處發(fā)生點(diǎn)突變(C→T)后，使RsaI酶識別部位消失，這2種等位基因形成C1/C1、C1/C2 和C2/C2 3種基因型，從而影響CYP2E1酶活性的表達(dá)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)CYP2E1基因多態(tài)性與ADIH發(fā)生相關(guān)，但存在爭議[11-12]，而且CYP2E1基因分布在人群中存在著明顯的種族差異[13]?？紤]到種族和基因多態(tài)性的情況，研究CYP2E1基因甲基化與ADIH發(fā)生的關(guān)系的報道甚少。本研究旨在探討蒙古族結(jié)核病患者CYP2E1基因多態(tài)性及啟動子區(qū)甲基化水平與ADIH的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2015年11月至2018年6月于內(nèi)蒙古通遼市結(jié)核病防治所進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化治療的135例蒙古族結(jié)核病患者。根據(jù)ADIH判定標(biāo)準(zhǔn)[14]選取發(fā)生肝損傷的蒙古族結(jié)核病患者為ADIH組(n=45)，按照1∶2比例匹配未發(fā)生肝損傷的蒙古族結(jié)核病患者為對照組(n=90)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)或胸部X線檢查診斷為結(jié)核的患者；②接受異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等一線抗結(jié)核藥物治療；③抗結(jié)核治療前肝功能檢查結(jié)果正常，治療期間有至少3次以上肝功能檢查結(jié)果；④在抗結(jié)核治療前未服用過其他影響肝功能的藥物(如對乙酰氨基酚等)；⑤研究對象為蒙古族，且祖上3代均無與外族通婚史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他肝疾病(如酒精性肝病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等)，或者其他可能導(dǎo)致肝功能紊亂的全身性疾?。虎诤喜⒂行?、肺、腦、腎、惡性腫瘤等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者；③嚴(yán)重營養(yǎng)不良患者、孕婦、精神疾病的患者等。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號:2018(003)]，患者均簽署知情同意書。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查查閱文獻(xiàn)、咨詢專家，制定ADIH相關(guān)因素調(diào)查問卷。調(diào)查內(nèi)容包括姓名、性別、出生日期、身高、體重、教育程度、婚姻狀況、職業(yè)等一般情況；吸煙、飲酒等生活習(xí)慣；既往患病史、抗結(jié)核藥物治療方案及肝功檢查結(jié)果等結(jié)核病相關(guān)因素。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1ADIH診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會與《中華結(jié)核和呼吸雜志》編輯委員制定的《抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》，間隔2周以上、連續(xù)2次檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)或谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)高于正常值上限(40 U/L)或總膽紅素高于2倍正常值上限(38 μmol/L)，或單次檢測ALT或AST高于2倍正常值上限(80 U/L)[14]。

1.3.2DNA提取采集患者靜脈血5 mL置于EDTA-K2抗凝管中，應(yīng)用全基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)，按照說明書方法提取300 μL靜脈血中的DNA，將DNA溶解于50 μL TE緩沖液中，-20 ℃儲存以用于后期CYP2E1基因多態(tài)性和甲基化水平檢測。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增CYP2E1基因從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲得CYP2E1 rs2031920基因及β球蛋白內(nèi)參序列信息，利用Oligo6.0軟件設(shè)計引物，β球蛋白內(nèi)參上游引物5'-GTAGACCACCAGCAGCCTAAG-3'，下游引物5'-CATCTGACTCCTGAGGAGAAGT-3'；CYP2E1 rs2031920上游引物5-GCAGCACAACCAATGACTTGCTT-3′，下游引物5- AATACATGAAAGAAGAAGCTAGTCA-3′，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。CYP2E1 rs2031920基因PCR產(chǎn)物長度414 bp，β球蛋白內(nèi)參PCR產(chǎn)物長度為232 bp。CYP2E1 rs2031920基因PCR擴(kuò)增體系：在50 μLPCR反應(yīng)體系中，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，超純水 20 μL，2×Taq Master Mix 25 μL。PCR擴(kuò)增條件：①195 ℃預(yù)變性5 min，②295 ℃變性1 min，③355 ℃退火1 min，④472 ℃延伸1 min，②-④步驟 35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.3.4CYP2E1rs2031920基因型確定方法首先取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入限制性內(nèi)切酶RsaI 1 μL、ddH2O 17 uL、green buffer 2 μL，37℃水浴3 h進(jìn)行酶切反應(yīng)。然后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗，若電泳實(shí)驗結(jié)果顯示某樣本有187 bp和227 bp 2條帶，則CYP2E1 rs2031920為C1/C1基因型；若顯示有187 bp、227 bp和414 bp 3條帶，則CYP2E1 rs2031920為C1/C2 基因型；若只有414 bp 1條帶，那么CYP2E1 rs2031920為C2/C2基因型。以此確定CYP2E1 rs2031920的基因型。

1.3.5CYP2E1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平檢測通過Agena MassArray?飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測CYP2E1基因啟動子區(qū)的甲基化水平，過程包括DNA質(zhì)控(DNA濃度>30 ng/μL，純度A260/A280為1.7～2.0，A260/A230>1.4)、合格DNA亞硫酸鹽處理(目的是將DNA中未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U)、PCR擴(kuò)增(上游引物序列為：5′-GTTTTGAGAAGGAGGGTGATTTATT，下游引物序列為3′-TCCTTCTAACCCCATTCATATAACA)、SAP 反應(yīng)、DNA轉(zhuǎn)錄、T切/RNAse A 消化反應(yīng)(將DNA轉(zhuǎn)錄的RNA片段切割成攜帶有CpG位點(diǎn)的小片段)、樹脂純化等?；蚣谆接嬎愎饺缦拢?/p>

基因甲基化水平=CpG片段數(shù)/(CpG片段數(shù)+CpA片段數(shù))

其中CpG代表甲基化的DNA，CpA代表未甲基化的DNA。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況ADIH組與對照組在性別、年齡、婚姻狀況、教育程度等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表 1 蒙古族結(jié)核病患者一般特征比較

Table 1 Comparison of general demographic characteristics of Mongolian tuberculosis patients

因素對照組(n=90)ADIH組(n=45)χ2值P值男/女(n)62/2826/191.6320.201年齡[n(%)]1.3530.245 <40歲48(53.33)19(42.22) ≥40歲42(46.67)26(57.78)婚姻狀況[n(%)]1.1110.574 未婚30(33.33)11(24.44) 已婚55(61.11)31(68.89) 離異或喪偶5(5.56)3(6.67)教育程度[n(%)]0.6930.707 小學(xué)及以下28(31.11)14(31.11) 初高中/中專46(51.11)26(57.78) 大專及以上16(17.78)5(11.11)職業(yè)[n(%)]0.6530.721 農(nóng)民35(38.89)16(35.57) 牧民7(7.78)5(11.11) 其他48(53.33)24(53.33)BMI[n(%)]1.780.411 <18.5 kg/m218(20.00)4(8.89) 18.5～23.9 kg/m253(58.89)29(64.44) ≥24 kg/m219(21.11)12(26.67)吸煙史(n)26120.0730.787飲酒史(n)1490.2250.635

2.2CYP2E1 rs2031920基因型分布135例患者中純合野生C1/C1型62例(45.93%)、雜合C1/C2型68例(50.37%)、純合突變C2/C2 型5例(3.70%)?；颊逤YP2E1 rs2031920位點(diǎn)C1/C1、C1/C2、C2/C2的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=3.22，P>0.05)。CYP2E1 rs2031920基因型在ADIH組和對照組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，檢驗效能是0.93。C1和C2基因頻率在ADIH組和對照組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表 2CYP2E1 rs2031920基因型及基因頻率的分布[n(%)]

Table 2 The distribution ofCYP2E1 rs2031920 genotype and gene frequencyn(%)

CYP2E1rs2031920對照組(n=90)ADIH組(n=45)χ2值P值基因型0.5500.760 C1/C142(46.67)20(44.44) C1/C244(48.89)24(53.33) C2/C24(4.44)1(2.22)基因頻率0.0001.000 C1128(71.11)64(71.11) C252(28.89)26(28.89)

M：Maker； 1-9：9個樣本的序號

圖 1CYP2E1 rs2031920酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 1 Agarose gel electrophoresis ofCYP2E1 rs2031920 enzymatic cleavage product

2.3CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平與ADIH的關(guān)系對135名蒙古族結(jié)核病患者提取的DNA進(jìn)行質(zhì)檢，僅80例患者(ADIH組27例，對照組53例)符合本研究對基因甲基化水平檢測要求。2組的性別、年齡、婚姻狀況、教育程度、職業(yè)、BMI等方面構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

CYP2E1基因啟動子區(qū)PCR擴(kuò)增目的片段大小為493 bp，該片段預(yù)測共包含9個CpG位點(diǎn)，本研究檢測到全部位點(diǎn)。其中CYP2E1_CpG_1.2.3的甲基化水平相近，將這3個位點(diǎn)合并為一個位點(diǎn)進(jìn)行分析。ADIH組和對照組在CYP2E1_CpG_1.2.3.4.5.6位點(diǎn)和總體甲基化水平間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表 3 2組符合甲基化檢測要求的患者一般人口學(xué)特征比較

Table 3 Comparison of general demographic characteristics of ADIH patients with methylation detection

因素對照組(n=53)ADIH組(n=27)χ2值P值男/女(n)30/2315/120.0080.929年齡[n(%)]1.3630.243 <40歲25(47.17)9(33.33) ≥40歲28(52.83)18(66.67)婚姻狀況[n(%)]0.8300.660 未婚11(20.75)3(11.11) 已婚38(71.70)22(81.48) 離異或喪偶4(7.55)2(7.41)教育程度[n(%)]1.2440.537 小學(xué)及以下18(33.96)8(29.63) 初高中/中專27(50.94)17(62.96) 大專及以上8(15.09)2(7.41)職業(yè)[n(%)]0.6500.722 農(nóng)民23(43.40)11(40.74) 牧民5(9.43)5(18.52) 非農(nóng)牧民25(47.17)11(40.74)BMI[n(%)]1.8740.392 <18.5kg/m212(22.64)4(14.81) 18.5～23.9 kg/m231(58.49)15(55.56) >24 kg/m210(18.87)8(29.63)吸煙(n)1480.0930.761飲酒(n)940.0320.857

CYP2E1基因CpG位點(diǎn)對照組ADIH組Z值P值CpG_1.2.30.697±0.0260.806±0.135-3.2070.001CpG_40.723±0.0370.663±0.098-2.9630.003CpG_50.856±0.0460.666±0.244-3.3750.001CpG_60.872±0.1590.803±0.152-2.4000.016CpG_70.846±0.1370.789±0.114-1.5490.121CpG_80.441±0.2860.372±0.327-1.0570.291CpG_90.881±0.0310.877±0.024-0.6040.546CpG_1～90.759±0.0620.711±0.085-2.4680.014

2.4 ADIH相關(guān)因素的Logistic回歸分析一般人口學(xué)特征和生活習(xí)慣等因素在ADIH組和對照組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，將CYP2E1 rs2031920基因C1/C1、C1/C2 、C2/C2基因型和CYP2E1基因總體甲基化水平4個變量代入條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，僅CYP2E1基因啟動子區(qū)總體甲基化水平與ADIH的發(fā)生有關(guān)(P<0.005)，甲基化水平每升高0.1個單位，ADIH的發(fā)生風(fēng)險降至0.388倍，OR值(95%CI)是0.388(0.204～0.739)。見表5。

表 5 ADIH相關(guān)影響因素的條件Logistic回歸分析

Table 5 Conditional logistic regression analysis of ADIH related factors

相關(guān)因素βSEWaldχ2P值OR(95%CI)CYP2E1rs2031920C1/C1型-0.8051.4760.2980.5850.447(0.025～8.057)CYP2E1rs2031920C1/C2型-0.8611.4540.3500.5540.423(0.024～7.315)CYP2E1rs2031920C2/C2型0.8051.4760.2980.585 2.238(0.124～40.340)CYP2E1基因啟動子區(qū)總體甲基化水平-0.9460.3298.2880.0040.388(0.204～0.739)

3 討 論

CYP2E1酶參與異煙肼和利福平的氧化代謝過程，其酶活性的改變可影響肝的代謝過程[15-16]。本研究中，蒙古族結(jié)核病患者CYP2E1 rs2031920基因位點(diǎn)的基因型以雜合子C1/C2型為主，占50.37%，CYP2E1 rs2031920基因多態(tài)性在ADIH組和對照組之間分布未見差異，條件logistics回歸也未發(fā)現(xiàn)CYP2E1 rs2031920基因多態(tài)性與ADIH發(fā)生相關(guān)，本研究的把握度達(dá)到了93%。這與Tang等[17]和Xiang等[18]研究結(jié)果一致。但也有相關(guān)報道稱CYP2E1 C1/C1基因型患者更易患肝損傷[19]。向陽等[20]分析顯示，攜帶CYP2E1 C1/C1基因型的成人結(jié)核病患者發(fā)生肝損害的危險性會增加；國外的一篇meta分析結(jié)果顯示CYP2E1 C1/C1基因型顯著增加了ADIH的患病風(fēng)險[21]。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是：①被調(diào)查人群種族不同，本研究納入人群均為三代以內(nèi)無外族通婚史的蒙古族結(jié)核病患者，在ADIH組和對照組間未發(fā)現(xiàn)一般人口學(xué)特征等因素存在差異，很好的純化了研究對象，本研究與Tang等[17]和Xiang等[18]的研究對象雖民族不同，但均屬亞洲人種，因此結(jié)果一致，而向陽[20]和國外的meta分析[21]包括亞洲、歐洲、非洲和美洲多種人種，有人種的混雜影響；②ADIH的發(fā)生受多個基因、環(huán)節(jié)及環(huán)境因素的影響，單個基因某一位點(diǎn)變異在整個機(jī)制中可能只起部分作用，本研究結(jié)果顯示CYP2E1基因rs2031920這一位點(diǎn)對ADIH發(fā)生的影響。

有研究表明，BMI、酒精、性別、年齡、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒或HIV感染等因素，都與ADIH的發(fā)生有關(guān)[22]?；騿幼訁^(qū)CpG島的甲基化可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，或通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象進(jìn)行間接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而影響基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響疾病的進(jìn)展[23-26]。為了更好地探討CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平與ADIH發(fā)生之間的關(guān)系，本研究將ADIH組和對照組中的性別、年齡、婚姻狀況、教育程度、職業(yè)、BMI、吸煙和飲酒因素進(jìn)行了匹配，進(jìn)一步證明這些因素在2組中分布均衡。本研究通過定量的方法對80例(ADIH組27例，對照組53例)蒙古族結(jié)核病患者的CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平進(jìn)行了檢測，調(diào)整CYP2E1 rs2031920 基因多態(tài)性對ADIH的影響，CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平高低仍與ADIH的發(fā)生有關(guān)，隨著甲基化水平的升高，ADIH發(fā)生的危險性逐漸降低，說明CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平是蒙古族ADIH發(fā)生的保護(hù)因素。這與鄧樂樂等[27]對蒙古族結(jié)核病患者的研究結(jié)果相一致。這與Zhang等[28]對漢族結(jié)核病患者的研究認(rèn)為CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化是ADIH發(fā)生的危險因素相悖。有關(guān)CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平與結(jié)核病患者患ADIH的關(guān)系存在爭議，原因可能是：①基因甲基化水平檢測方法不同，本研究使用MassArrAy 系統(tǒng)檢測基因甲基化水平，檢測的基因長度為493bp，精確檢測該片段的9個CpG位點(diǎn)的甲基化水平，是定量檢測；其他研究多是采用EZ DNA甲基化試劑盒和甲基化特異性 PCR技術(shù)，檢測的基因長度為200bp～300bp，對基因是處于甲基化狀態(tài)或非甲基化狀態(tài)進(jìn)行定性研究。②混雜因素的控制，此次的病例對照研究，各影響因素在ADIH組和對照組中分布均衡。另外，目前有關(guān)藥物代謝酶基因甲基化水平與ADIH發(fā)生相關(guān)性的人群研究極少，且結(jié)果間存在較大差異，尚沒有系統(tǒng)綜述或meta分析描述兩者之間的關(guān)系，這需要我們進(jìn)一步研究證實(shí)，為ADIH的發(fā)生發(fā)展尋求更多依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蒙古族結(jié)核病患者ADIH的發(fā)生與CYP2E1 rs2031920基因多態(tài)性不相關(guān)，但與CYP2E1基因啟動子區(qū)甲基化水平的高低存在相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)為深入研究ADIH的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路和證據(jù)。