王濤，汪凱，李亞強，胡盼盼，張梅，余傳慶，薛敏

(1.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科，合肥 230022；2.安徽省淮南市第一人民醫(yī)院神經內科、安徽理工大學第一附屬醫(yī)院神經內科，淮南 232007)

在腦組織缺血-再灌注過程中，氧化應激反應過程和細胞凋亡過程過度激活是造成缺血-再灌注損傷的關鍵[1-2]，抑制氧化應激和細胞凋亡是減輕缺血-再灌損傷、改善再灌注治療效果的重要靶點。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、花生等天然植物中的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等廣泛的生物學活性，對心腦血管系統(tǒng)具有確切保護效應[3]。國內研究報道，Res能夠減輕神經元缺氧復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷，但關于細胞凋亡情況及氧化應激反應程度尚不明確[4]。筆者在本實驗以神經元H/R模型模擬腦組織缺血-再灌注過程，以了解Res對神經元H/R過程中細胞凋亡、氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Res(購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：111535-201703)，PC12細胞株購于中國科學院細胞庫(貨號：C161832)，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、神經生長因子購買于Gibco公司(批號分別為1912，0418A，180221C)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5 -(3-羧甲酯基)-2 -(4 -磺苯基)-2H-四唑[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]細胞活力檢測試劑盒購于Promega公司(批號：YK180612131)，2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天公司(批號：BYT18110217A)，放射免疫沉淀試劑盒購買于南京建成公司(批號：18110415A)，RNA提取、cDNA合成、熒光定量PCR試劑盒購買于北京天根公司(批號分別為18051922，18102913，18112109)；丙二醛酶聯(lián)免疫試劑盒、人晚期氧化蛋白產物檢測試劑盒、人8-羥基脫氧鳥苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)檢測試劑盒均購自深圳晶美生物科技有限公司(貨號分別為CEA597Ge，BYS11062B，xy-E10798)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)和處理 PC12細胞復蘇后用含10%胎牛血清、50 ng·mL-1神經生長因子的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導PC12細胞向神經元分化。鏡下觀察到細胞長出長突起，即認為誘導分化成功，然后進行消化傳代。傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板中，并分為對照組、H/R組和不同濃度(40，80 μmol·L-1)Res組。分別按照下列方法處理：對照組用無血清DMEM培養(yǎng)基在常氧培養(yǎng)箱[37 ℃、5%二氧化碳(CO2)]培養(yǎng)，H/R組用無血清DMEM培養(yǎng)基在缺氧培養(yǎng)箱[37 ℃、5%CO2、95%氮氣(N2)]中缺氧培養(yǎng)2 h后在常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)；不同濃度Res組參照文獻[4]研究結果，分別給予40和80 μmol·L-1Res處理，無血清DMEM培養(yǎng)基在缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、95%N2)中缺氧培養(yǎng)2 h后，在常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細胞活力的檢測 復氧后12，24，48 h，向培養(yǎng)基中加入MTS試劑盒檢測液，繼續(xù)在培養(yǎng)基中孵育4 h，然后取出培養(yǎng)板，并在酶標儀上測定450 nm波長處吸光度值(A值)，細胞增殖活力值=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值。

1.2.3細胞中氧化應激產物的檢測 復氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細胞，加入蛋白裂解液后充分裂解細胞，提取蛋白質，再采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒測定活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。采用丙二醛酶聯(lián)免疫試劑盒、人晚期氧化蛋白產物檢測試劑盒、人8-OHdG檢測試劑盒分別對丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白產物(human advanced oxidation protein products，AOPP)、8-OHdG含量進行測定，均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法。

1.2.4細胞中基因mRNA表達量的檢測 復氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細胞，加入Trizol裂解液后充分裂解，再采用RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒分離細胞中總RNA并反轉錄為cDNA；取cDNA樣本，使用熒光定量PCR試劑盒擴增Bcl-2、Bax、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，引物序列為aattggtacc atttggatgc caacaccgat cattgggcgt ttgttgatca attgcacgcc，根據(jù)擴增曲線讀取循環(huán)閾值，以GAPDH為內參計算Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達量。

1.2.5細胞中蛋白表達的免疫組化染色 復氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細胞，4%多聚甲醛固定細胞，免疫組化染色試劑盒進行操作，孵育Bcl-2、Bax、Caspase-3的多克隆抗體過夜后孵育二抗，而后進行二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色、蘇木精復染，顯微鏡下觀察、攝影記錄圖像并測定A值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0版軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學處理，3組間計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖活力 復氧后12，24，48 h，對照組細胞的增殖活力明顯高于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組高于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組高于H/R組，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2細胞中氧化應激產物含量 復氧后48 h對照組ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量均明顯低于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組低于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組低于H/R組，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 4組細胞增殖活力比較

組別12 h24 h48 h對照組77.10±1.1085.40±1.2595.11±1.20H/R組55.89±1.11①②③64.50±1.10①②③73.85±1.15①②③Res組 40 μmol·L-167.68±1.12①②77.42±1.18①②82.90±1.10①② 80 μmol·L-172.42±1.08①81.35±1.15①88.88±1.12①

①與對照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表2 4組細胞中氧化應激產物含量比較

組別ROS(MFI平均熒光強度)MDA/(μmol·L-1)對照組0.83±0.113.48±0.52H/R組2.42±0.38①②③10.38±1.65①②③Res組 40 μmol·L-11.79±0.22①②7.65±0.77①② 80 μmol·L-11.20±0.25①5.80±0.85①組別AOPP/(μmol·L-1)8-OHdG/(ng·mL-1)對照組2.29±0.361.95±0.23H/R組6.52±0.94①②③5.51±0.79①②③Res組 40 μmol·L-15.44±0.52①②4.04±0.55①② 80 μmol·L-13.89±0.41①3.00±0.60①

①與對照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

2.3細胞中線粒體途徑凋亡分子表達量 復氧后48 h對照組Bax、Caspase-3、BaxmRNA表達量、Caspase-3mRNA表達量均明顯低于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組低于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組低于H/R組，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組Bcl-2、Bcl-2mRNA表達量均明顯高于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組高于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組高于H/R組，均差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表3，4。

表3 4組細胞中線粒體途徑凋亡分子表達量比較

組別Bcl-2BaxCaspase-3對照組1.00±0.161.00±0.191.00±0.14H/R組0.39±0.06①②③2.32±0.37①②③2.55±0.41①②③Res組 40 μmol·L-10.76±0.10①②1.89±0.21①②2.02±0.29①② 80 μmol·L-10.88±0.12①1.44±0.20①1.65±0.30①

①與對照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表4 4組細胞中線粒體途徑凋亡分子mRNA表達量比較

組別Bcl-2mRNABaxmRNACaspase-3mRNA對照組0.418±0.0620.215±0.0420.239±0.039H/R組0.252±0.036①②③0.511±0.083①②③0.475±0.062①②③Res組 40 μmol·L-10.303±0.005①②0.342±0.061①②0.351±0.054①② 80 μmol·L-10.338±0.006①0.288±0.059①0.297±0.048①

①與對照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

3 討論

已有研究證實，Res對心腦血管具有保護作用，長期攝入Res能夠降低心腦血管疾病發(fā)生風險[5-6]。缺血-再灌注損傷可嚴重影響腦梗死治療效果，Res對神經元氧化應激損傷具有保護作用[7]。本研究中，筆者將神經元H/R損傷模型作為研究Res抗凋亡和抗氧化作用的工具。為明確H/R過程對神經元的損傷程度，筆者分析了細胞增殖活力，結果顯示H/R組細胞復氧后12，24，48 h時增殖活力值均低于對照組，提示H/R模型細胞增殖受到顯著抑制。在此基礎上進一步分析Res對神經元H/R損傷的影響可知，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res組細胞復氧后12，24，48 h時增殖活力值均顯著高于H/R組，且增殖活力值隨著Res濃度升高而提高。這一結果與文獻 [4，7]報道一致，說明Res能夠減輕H/R所致神經元損傷。

氧化應激反應激活是H/R損傷過程中重要的病理環(huán)節(jié)，處于缺氧狀態(tài)的組織和細胞獲得血流灌注后會造成ROS大量產生，進而引起細胞中脂質、蛋白質、核酸發(fā)生過氧化并生成相應的氧化產物MDA、AOPP、8-OHdG[8-10]。筆者對H/R后細胞中氧化應激產物的分析發(fā)現(xiàn)，H/R組細胞ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量顯著高于對照組，提示H/R能激活神經元氧化應激反應，導致ROS生成增加并造成細胞脂質、蛋白質、核酸發(fā)生過氧化，進而導致神經元結構和功能損傷。Res抗氧化作用和氧自由基清除作用得到一致認可，筆者對Res處理后細胞中氧化應激產物的分析證實，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res組細胞中ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量顯著低于H/R組，且隨著Res濃度提高，氧化應激反應減輕，提示Res能夠抑制神經元H/R損傷過程中的氧化應激反應，減輕氧化應激反應對神經元的損傷。

Bax和Bcl-2是調節(jié)線粒體功能以及線粒體膜對細胞色素C通透性的重要分子，前者能夠形成同源二聚體并定位于線粒體膜，增加線粒體膜對細胞色素C的通透性，進入胞質的細胞色素C能夠激活Caspase-3并誘導細胞凋亡；后者能夠與Bax形成異源二聚體并抑制Bax的促凋亡作用[11-12]。筆者對神經元H/R過程中上述線粒體途徑凋亡分子表達量的分析發(fā)現(xiàn)，H/R能夠顯著抑制Bcl-2水平，增加Bax、Caspase-3表達；Res組細胞中Bcl-2的mRNA表達量顯著高于H/R組，Bax、Caspase-3的mRNA表達量顯著低于H/R組，且該效果與Res濃度間存在密切關聯(lián)，提示Res能夠抑制神經元H/R損傷過程中線粒體途徑細胞凋亡。

綜上所述，Res能夠減輕神經元H/R損傷，抑制H/R過程中的細胞凋亡和氧化應激反應是Res發(fā)揮神經元保護作用的分子機制之一。