劉鑫，牛子冉，梅丹，張波

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥劑科，北京 100730；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

近年來(lái)，隨著生活水平提高以及人口老齡化，我國(guó)心血管疾病患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。降脂治療可顯著降低心血管事件和病死率。阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)屬于他汀類降脂藥，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成限速酶從而降低體內(nèi)膽固醇和脂蛋白水平，降低心血管危害發(fā)生率，是目前最暢銷的藥物之一[2-4]。然而，肝酶升高和橫紋肌溶解等不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用[5-6]。

異綠原酸B(isochlorogenic acid B，ICAB)是來(lái)源于藥用植物金銀花的一種多酚類化合物，本課題組以往的研究表明，ICAB對(duì)四氯化碳致急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用[7]。氧化應(yīng)激與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件(NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE)氧化應(yīng)激信號(hào)通路的激活在防治化學(xué)性、藥物性和免疫性肝損傷及肝臟腫瘤中發(fā)揮重要作用[8]。筆者在本研究建立ATO誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，評(píng)價(jià)ICAB的肝保護(hù)作用，并基于Nrf2/ARE信號(hào)通路探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 ICAB購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：B21540，HPLC法檢測(cè)含量>98%)；ATO購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司(批號(hào)：120531H，分析純)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號(hào)：20141214)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào)：20141216)、丙二醛(MDA，批號(hào)：20141029)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20141106)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px，批號(hào)：20141108)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所；蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：P00112S)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel/eletrophoresis,SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(批號(hào)：P0012A)和2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)蛋白上樣緩沖液(批號(hào)：P0015A)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Nrf2抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(批號(hào)：K2008)；β-actin單克隆抗體(批號(hào)：TA09)購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2動(dòng)物分組及給藥 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和ICAB小、中、大劑量組(5，10和20 mg·kg-1)，每組10只。

ICAB用0.9%氯化鈉溶液配成相應(yīng)濃度溶液。具體給藥方案如下：除空白對(duì)照組外，其他各組灌胃給予ATO 12 mg·kg-1·d-1。ICAB小、中、大劑量組同時(shí)灌胃給予相應(yīng)劑量ICAB，qd；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，qd。均連續(xù)9 d，9 d后小鼠禁食過(guò)夜，次日經(jīng)頸動(dòng)脈取血，血樣1400×g離心10 min，分離血清，凍存于-80 ℃冰箱備用。取肝臟大葉同一部位，10%甲醛固定，蘇木精-伊紅(HE)染色，病理學(xué)檢查。剩余肝組織置于液氮冷凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3小鼠血清ALT與AST水平測(cè)定 取小鼠血清，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。

1.4肝生化指標(biāo)測(cè)定 取小鼠肝組織，冰浴，以 9倍體積0.9%氯化鈉溶液制成肝勻漿，-4 ℃、13 400×g離心15 min，去除細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。取上清液，分裝，測(cè)定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。分光光度法測(cè)定肝組織勻漿MDA、GSH含量及SOD和GSH-Px活性。

1.5肝組織病理學(xué)檢查 取各組小鼠肝臟同一部位，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.6Western blotting印跡法檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá) 按步驟分別提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞核內(nèi)蛋白，二喹啉甲酸(bicin choninic acid,BCA)法測(cè)定蛋白含量，加入SDS上樣品緩沖液，煮沸10 min；以同等蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液發(fā)光，儀器攝影。

1.7免疫熒光技術(shù)觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位 取肝組織石蠟切片，用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液洗3次，于37 ℃孵箱封閉1 h。4 ℃孵一抗過(guò)夜。預(yù)冷1×PBS洗3次，每次5 min，孵二抗于37 ℃ 避光30 min；加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料，蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡下攝影。

1.8實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase,NQO1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞單位(glutamyl semidomine ligase catalyzed subunit，GCLC)表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書抽提肝組織總RNA，測(cè)定A260/A280為1.8～2.0，純度>90%后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后擴(kuò)增HO-1、NQO1、GCLC mRNA。按PCR試劑盒操作，PCR反應(yīng)體系為25 μL。具體擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，(94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)×39個(gè)循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshhold，Ct)值，使用β- actin校正后求得△Ct，根據(jù)2-△△Ct計(jì)算HO-1、NQO1和GCLC相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1ICAB對(duì)小鼠血清ALT和AST水平的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清ALT和 AST水平均明顯升高(P<0.01)，提示ATO誘導(dǎo)小鼠肝損傷造模成功。與模型對(duì)照組比較，ICAB 不同劑量組小鼠血清ALT與AST水平均明顯降低(P<0.01)，結(jié)果見圖1。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.ICAB小劑量組；D.ICAB中劑量組；E.ICAB大劑量組；①與空白對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

A.blank control group；B.model control group；C.ICAB low-dose group；D. ICAB median-dose group；E.ICAB high-dose group；①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01.

2.2ICAB對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變的保護(hù)作用 病理學(xué)結(jié)果表明，空白對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細(xì)胞正常；模型對(duì)照組肝臟可見肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝束排列不齊，肝竇明顯狹窄，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、灶性壞死、大片狀出血壞死等改變；ICAB各劑量組小鼠肝組織病理改變均不同程度好轉(zhuǎn)，結(jié)果見圖2。

2.3ICAB 對(duì)小鼠肝組織MDA和GSH含量及SOD、GSH-Px活性的影響 見表1。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝組織MDA水平明顯增高，SOD和GSH-Px活性以及GSH含量明顯降低，提示ATO可顯著影響小鼠肝細(xì)胞抗氧化能力；與模型對(duì)照組比較，ICAB中和大劑量組肝組織MDA水平顯著降低，肝組織SOD和GSH-Px活性顯著升高，肝組織GSH含量顯著提高(表1)。

2.4ICAB對(duì)小鼠肝臟Nrf2蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的影響 Nrf2 蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠肝組織總Nrf2、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 表達(dá)均較低，模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞總Nrf2、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)有上升趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同劑量ICAB均可顯著提高Nrf2 核轉(zhuǎn)位，也可顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)總Nrf2 表達(dá)(圖3)。

2.5ICAB對(duì)小鼠肝臟HO-1、NQO1、GCLC mRNA表達(dá)水平的影響 PCR模型對(duì)照組HO-1、NQO1、GCLC表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ICAB可劑量依賴性上調(diào)HO-1、NQO1、GCLC的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討論

ATO是一種具有良好降血脂效果的藥物，但近年來(lái)ATO肝毒性不良反應(yīng)引起廣泛關(guān)注[9]。此外，針對(duì)13 749例患者的臨床研究結(jié)果顯示，6093，2542，1983和3131例患者分別服用劑量為10，20，40 和80 mg·d-1ATO后，轉(zhuǎn)氨酶異常升高發(fā)生率分別為0.13%，0.12%，0.4%和0.89%，提示ATO所致轉(zhuǎn)氨酶升高具有劑量依賴性[10]。

中醫(yī)藥在清熱解毒、保肝護(hù)肝方面有豐富的理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。金銀花具有治療濕熱黃疸、細(xì)菌感染等作用，可用于解熱抗炎、降脂、利膽保肝[11]。ICAB是從金銀花中提取的多酚類化合物，具有抗氧化、保肝和抗神經(jīng)退行性疾病等生物活性[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ICAB可以逆轉(zhuǎn)ATO所致小鼠血清ALT和AST含量升高。組織病理結(jié)果表明，ICAB還可以改善ATO所致肝細(xì)胞壞死性改變。

圖2 5組小鼠肝組織病理特征(HE，×20)

表1 5組小鼠肝組織GSH、MDA 水平和SOD、 GSH-Px活性測(cè)定結(jié)果

組別肝臟GSH/(mg·g-1)肝臟MDA/(nmol·mg-1)肝臟SOD活性肝臟GSH-Px活性(U·mg-1)空白對(duì)照組2.52±0.710.59±0.17633.58±159.21394.81±125.81模型對(duì)照組1.52±0.52 ①0.85±0.15①389.44±154.70①266.85±98.74①ICAB 小劑量組1.75±0.290.79±0.10431.58±99.19287.96±88.28 中劑量組2.13±0.34②0.66±0.17③479.46±157.51②375.25±92.28② 大劑量組2.97±0.50③0.62±0.23③690.43±174.07③395.01±95.74③

①與空白對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05；③compared with model control group，P<0.01.

A.肝臟Nrf2免疫熒光(比例尺=50 μm)；B.Nrf2熒光強(qiáng)度；C.細(xì)胞核Nrf2表達(dá)；D.總Nrf2表達(dá)；a.空白對(duì)照組；b.模型對(duì)照組；c.ICAB小劑量組；d.ICAB中劑量組；e.ICAB大劑量組；①與模型對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

A.fluorescence staining of Nrf2 in the liver (scale bar=50 μm)；B.fluorescence intensity of Nrf2；C.nuclear expression of Nrf2；D.total expression of Nrf2；a.blank control group；b.model control group；c.low-dose ICAB group；d.median-dose ICAB group；e.high-dose ICAB group；①Compared with model control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05.

A.空白對(duì)照組；b.模型對(duì)照組；c.ICAB小劑量組；d.ICAB中劑量組；e.ICAB大劑量組；①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

A.blank control group；b.model control group；c.low-dose ICAB group；d.median-dose ICAB group；e.high-dose ICAB group；①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01.

Nrf2是亮氨酸拉鏈家族中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常生理狀態(tài)下，Nrf2通過(guò)N端與kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(kelch-like ECH associated protein 1，Keap1)特異性結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)Nrf2活性受到抑制，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，抗氧化物酶未被誘導(dǎo)。遭受氧化損傷時(shí)，Nrf2與Keap1偶聯(lián)解離，Nrf2轉(zhuǎn)位入核，識(shí)別并結(jié)合ARE，促進(jìn)下游抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。Nrf2-ARE通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，使機(jī)體和細(xì)胞抵御活性氧和有毒物質(zhì)的侵害。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠單獨(dú)給予ATO也可輕微提高Nrf2核轉(zhuǎn)位，這可能是肝細(xì)胞對(duì)外界刺激作出的防御性應(yīng)激反應(yīng)。而ICAB可顯著上調(diào)Nrf2表達(dá)并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位。Nrf2入核轉(zhuǎn)位后，與ARE 結(jié)合啟動(dòng)下游HO-1、NQO1、GCLC基因表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，ICAB 對(duì)ATO誘導(dǎo)的藥物性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2入核，增強(qiáng)肝組織中HO-1、NQO1和GCLC表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激相關(guān)。