張浩然，徐 汀，張亦菲，田 愷，華賢輝，商 軍

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

吲哚美辛為解熱鎮(zhèn)痛類非甾體抗炎藥，收載于《中華人民共和國藥典》2015年版(二部)[1]，《中華人民共和國獸藥典》中并未收載。該藥物主要通過抑制環(huán)氧合酶的合成，下調(diào)體溫中樞的溫度調(diào)定點(diǎn)，從而使機(jī)體達(dá)到正常的產(chǎn)熱散熱平衡，故可用來治療非特異性發(fā)熱[2]。但其副作用大，長期使用的不良反應(yīng)發(fā)生率為35%～50%[3]，如消化性潰瘍、穿孔、水腫、高血壓等[4]。最近，在獸藥監(jiān)督抽檢工作中首次發(fā)現(xiàn)了中獸藥梅香片中非法添加吲哚美辛的情況，因此有必要建立清熱解毒類中獸藥中非法添加吲哚美辛的檢測方法。

板二黃片由黃芪、淫羊藿、鹽黃柏、山楂及地黃五味藥材用水煎煮，濾過濃縮至膏狀后，先與板藍(lán)根細(xì)粉混勻制粒，后粉碎并與連翹、白術(shù)粉末混勻，過篩，加入適量輔料，制粒壓片而成[5]；三黃散由黃芩、黃柏、大黃及大青葉四味藥材粉碎、過篩、混勻而成[5]；扶正解毒散主要是由板藍(lán)根、黃芪和淫羊藿三味中藥材粉碎、過篩、混勻而成[6]。因此，為使本法有一定的代表性，本文選取了工藝、成分均較復(fù)雜的板二黃片以及相對簡單的三黃散和扶正解毒散，在參考了相關(guān)文獻(xiàn)后[7-9]，結(jié)合非法添加檢測方法的技術(shù)特點(diǎn)，建立了清熱解毒類中獸藥中非法添加吲哚美辛的HPLC-PDA檢測方法，為中獸藥中非法添加吲哚美辛的檢測提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Waters e2695，配二極管陣列檢測器(PDA)，沃特世公司；電子天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；純水機(jī)：Molatom 1810A，中國重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 試藥 吲哚美辛對照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號為G832449，含量99.4%)；實(shí)驗(yàn)用水(電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682一級用水的規(guī)定)；乙腈(色譜純)；乙酸(色譜純)；板二黃片陰性樣品(批號：20181001)；三黃散陰性樣品(批號：17070255)；扶正解毒散陰性樣品(批號：2016110201)；梅香片陽性樣品(批號：20190301)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：采用ODSC18色譜柱(柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm)；流動相∶乙腈∶0.1 mol/L冰醋酸(50∶50，V1∶V2)；流速∶1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；PDA參考條件：采集波長范圍200 ～ 400 nm，分辨率為1.2 nm；定量波長：317 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取供試品1 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入流動相20.00 mL，超聲提取20 min，靜置，濾過，精密量取濾液1.00 mL置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備溶液 取吲哚美辛對照品100.35 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。

2.2.3 對照品工作溶液 精密量取1.00 mL對照品儲備溶液置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，濾液作為對照品工作溶液。

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液 以對照品工作溶液(2.2.3)作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液，建立光譜數(shù)據(jù)庫。

2.3 供試品的測定 按照2.1的色譜條件及2.2的溶液制備方法，將供試品溶液和對照品工作溶液注入高效液相色譜儀。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得吲哚美辛的含量。

2.4 線性關(guān)系考察 將對照品儲備液精密稀釋，制備200、100、50、20、10、5 μg/mL的吲哚美辛對照品溶液。每個濃度點(diǎn)重復(fù)5次進(jìn)樣，按照2.1的色譜條件進(jìn)行測定，以吲哚美辛對照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，以相應(yīng)濃度測得的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程為y= 11214x- 10416。本方法在吲哚美辛濃度為5 ～ 200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)。

2.5 專屬性考察 取板二黃片陰性樣品、三黃散陰性樣品及扶正解毒散陰性樣品，按照2.2的制備方法得到空白基質(zhì)溶液。通過空白基質(zhì)溶液及對照品工作溶液進(jìn)行專屬性試驗(yàn)。結(jié)果表明，基質(zhì)對吲哚美辛的出峰沒有干擾，不影響含量測定。典型色譜圖見圖1～圖4。

圖1 吲哚美辛的色譜圖(0.1 mg/mL)Fig 1 Chromatogram of Indomethacine (0.1 mg/mL)

圖2 板二黃片陰性基質(zhì)溶液的色譜圖Fig 2 Negative solution chromatogram of Ban’er Huang tablets

圖3 三黃散空白基質(zhì)溶液的色譜圖Fig 3 Negative solution chromatogram of Sanhuang power

圖4 扶正解毒散空白基質(zhì)溶液的色譜圖Fig. 4 Negative solution chromatogram of Fuzheng Jiedu power

2.6 峰純度檢查 取板二黃片陰性樣品、三黃散陰性樣品及扶正解毒散陰性樣品各1 g，加入適量對照品儲備溶液，制成吲哚美辛添加量為1 g/kg的陰性添加樣品，按照2.1的色譜條件及2.2處理方法制成峰純度檢查溶液，進(jìn)行測定。結(jié)果表明，樣品色譜峰的純度角度均小于純度閾值，說明吲哚美辛的出峰沒有干擾，可確定為單一物質(zhì)峰(表1)。

表1 峰純度和光譜相似度檢查結(jié)果表Tab 1 The results of peak purity and spectra matching test

2.7 光譜相似度檢查 將峰純度檢查溶液(2.6)中吲哚美辛的光譜圖和光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。結(jié)果表明，PDA匹配角度均小于PDA匹配閾值，說明光譜的相似度高，可確定為同一物質(zhì)(表1)。

2.8 檢測限 取板二黃片陰性樣品、三黃散陰性樣品及扶正解毒散陰性樣品各1 g，逐級加入適量對照品儲備溶液，制成吲哚美辛添加量為2 g/kg、1 g/kg、0.4 g/kg的陰性添加樣品，按照2.1的色譜條件及2.2處理方法進(jìn)行測定?？紤]到非法添加的成分含量大都較高，故選擇光譜圖失真的最大濃度作為本方法的檢測限[10]。結(jié)果表明，檢測限為1.0 g/kg。典型圖譜見圖5～圖10。

圖5 板二黃片中添加吲哚美辛的色譜圖(1 g/kg)Fig 5 Chromatogram of Indomethacine added in Ban’er Huang tablets (1 g/kg)

圖6 板二黃片中添加吲哚美辛的光譜圖(1 g/kg)Fig 6 Spectrum of Indomethacine added in Ban’er Huang tablets (1 g/kg)

圖7 三黃散中添加吲哚美辛的色譜圖(1 g/kg)Fig 7 Chromatogram of Indomethacine added in Sanhuang powder (1 g/kg)

圖8 三黃散中添加吲哚美辛的光譜圖(1 g/kg)Fig 8 Spectrum of Indomethacine added in Sanhuang powder (1 g/kg)

圖9 扶正解毒散中添加吲哚美辛的色譜圖(1 g/kg)Fig 9 Chromatogram of Indomethacine added in Fuzheng Jiedu power (1 g/kg)

圖10 扶正解毒散中添加吲哚美辛的光譜圖(1 g/kg)Fig 10 Spectrum of Indomethacine added in Fuzheng Jiedu power (1 g/kg)

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取板二黃片陰性樣品、三黃散陰性樣品及扶正解毒散陰性樣品各1 g,加入適量對照品儲備溶液，制成吲哚美辛添加量約為3 g/kg的陰性添加樣品。每個基質(zhì)6個平行，按照2.1的色譜條件及2.2處理方法，進(jìn)行測定。板二黃片中吲哚美辛的平均回收率為96.5%，RSD為0.9%；三黃散中吲哚美辛的平均回收率為99.3%，RSD為1.3%；扶正解毒散中吲哚美辛的平均回收率為100.6%，RSD為0.8%(表2)。試驗(yàn)結(jié)果符合《中華人民共和國獸藥典》[11]2015年版附錄9101的要求。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 The results of accuracy test (n=6)

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.2的處理方法，制備各基質(zhì)陰性添加的供試品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，室溫下分別在0、4、8、12、16、20、24 h后按照2.1的色譜條件進(jìn)行測定。吲哚美辛峰面積的RSD均小于0.6%，說明供試品溶液24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性試驗(yàn) 選取各基質(zhì)的準(zhǔn)確度試驗(yàn)溶液進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，考察柱溫及不同色譜柱的影響。調(diào)節(jié)柱溫分別為25℃、30℃、35℃，結(jié)果表明，隨著柱溫的提升，吲哚美辛的出峰時間略有提前，相差約1 min；不同規(guī)格及不同廠商的色譜柱(Shiseido MGⅡ 250 mm×4.6 mm，5 μm；Shiseido MGⅡ 150 mm×4.6 mm，5 μm；Waters symmetry 150 mm×4.6 mm，5 μm)在本方法中所得的吲哚美辛色譜峰的理論塔板數(shù)、拖尾因子均符合檢測要求，說明本方法耐用性較好。

2.12 陽性供試品測定 采用本法，對梅香片陽性樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明，該陽性樣品中吲哚美辛的添加量為15 g/kg，具體結(jié)果見表3，圖11。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的確定 將對照品工作溶液按照2.1的色譜條件注入液相色譜儀，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，選擇其最大吸收波長317 nm作為定量波長。

3.2 流動相的選擇 本文參考了《中華人民共和國藥典》[1]中吲哚美辛腸溶片的液相色譜條件，該條件下，吲哚美辛色譜峰的對稱性好，出峰時間適宜，在基質(zhì)中不受其他雜質(zhì)峰的干擾，故選擇乙腈：0.1 mol/L冰醋酸(50∶50，V1∶V2)為流動相，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[12～14]。

3.3 陽性樣品的確證 對于非法添加陽性樣品的確證，除保留時間要求一致外，還需要輔以最大吸收波長、峰純度和光譜相似度三個條件。首先，供試品和對照品的紫外光譜圖相匹配，并且最大吸收波長相差不超過±2 nm。其次，利用事先建立的光譜數(shù)據(jù)庫，可以進(jìn)行峰純度和光譜相似度檢查，若純度角度小于純度閾值，則確認(rèn)為單一物質(zhì)；若匹配角度小于匹配閾值，則認(rèn)為光譜高度相似。最后，結(jié)合以上四個條件，避免了保留時間一致但光譜不同的物質(zhì)的干擾，從而做出確證。

表3 陽性樣品檢測結(jié)果表(n=2)Tab 3 The results of the positive sample test (n=2)

圖11 梅香片陽性樣品中吲哚美辛的純度圖Fig 11 Purity plot of Indomethacine in Meixiang tablets

3.4 本法的通用性 本文利用建立好的方法對陽性供試品(2.12)梅香片中的吲哚美辛進(jìn)行檢測。結(jié)合3.3中總結(jié)的四個條件，完成了梅香片中吲哚美辛的確證(表3)并進(jìn)行了定量。此外，為驗(yàn)證定量的準(zhǔn)確性，按照添加量和本底濃度之比為0.8∶1，1∶1，1.2∶1進(jìn)行低、中、高三種濃度的準(zhǔn)確度試驗(yàn)，每個濃度3份平行，得到平均回收率為101.2%，RSD為0.4%～1.1%。結(jié)果表明，本法定量準(zhǔn)確。因此，本方法在兩種散劑和兩種片劑基質(zhì)的應(yīng)用，體現(xiàn)了較好的通用性。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本法操作簡便快速，準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可應(yīng)用于中獸藥中非法添加吲哚美辛的檢測工作。