吳劍平，姜芹，王博，嚴(yán)鳳，張文剛，黃士新

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

普魯卡因青霉素，其化學(xué)名為對氨基苯甲?；?-(二乙氨基)乙酯(6R)-6-(2-苯基乙酰氨基)-青霉烷酸鹽一水合物[1]，分子式為：C13H20N2O2·C16H18N2O4S·H2O，CAS No：54-35-3。其屬于內(nèi)酰胺類抗生素，是在青霉素G 的基礎(chǔ)上研制出來的下一代長效青霉素，其克服了青霉素G 作用時(shí)間短的缺點(diǎn)，主要用于革蘭氏陽性菌感染，亦用于放線菌及鉤端螺旋體等感染。在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，普魯卡因青霉素作為使用最廣泛的治療乳牛乳腺炎、陰道炎和其他疾病的抗生素，獲得了良好的療效[2-3]。目前《中國獸藥典》二一五年版一部、《美國藥典》USP36-NF31及《英國藥典》2013年版獸藥卷收載了該產(chǎn)品[4-6]。根據(jù)獸藥典辦[2012]9號文件，按中國獸藥典辦的任務(wù)要求，曾于2015年對擬收載于《中國獸藥典》二一五年版一部的普魯卡因青霉素注射液進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核工作，對其中有關(guān)該產(chǎn)品各項(xiàng)目技術(shù)指標(biāo)及檢測方法進(jìn)行了驗(yàn)證，并作了進(jìn)一步的修訂[7]。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，超高效液相色譜(UPLC)正日益普及，其相比于傳統(tǒng)液相色譜具有分離效率高，分析速度快，溶劑消耗小等優(yōu)點(diǎn)[8-11]。親水相互作用色譜(HILIC)在分析極性化合物時(shí)比傳統(tǒng)反相色譜更高的保留能力，可運(yùn)用在強(qiáng)極性化合物的色譜分析中[12-15]。在實(shí)際檢測普魯卡因青霉素注射液過程中發(fā)現(xiàn)一些問題有待解決：①由于其劑型為無菌油混懸液，對含量測定項(xiàng)下的精密量取一定體積較為不便； ②普魯卡因和青霉素為強(qiáng)極性化合物，兩者保留差異較大導(dǎo)致單針分析時(shí)間過長；③由于普魯卡因方法所使用流動(dòng)相中含有高比例鹽和離子對試劑，對色譜柱損害較大。上述這些問題可以通過UPLC結(jié)合HILIC方法解決。

1 材料和方法

1.1 儀器 UPLC H-Class超高效液相色譜、Empower2控制軟件、eλ-PDA紫外二極管陣列檢測器等(Waters, 美國)、高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 青霉素對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0251509，93.6%)，普魯卡因?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號：100424-201102，99.8%)，普魯卡因青霉素注射液(某獸藥生產(chǎn)企業(yè)，規(guī)格：10 mL：300萬單位，批號：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)甲酸銨(分析純)，甲酸、乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、石油醚(色譜純)；去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

1.3 色譜條件色譜柱 HILIC分析柱(Thermo AccucoreHILIC100×2.1mm，2.6 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min,進(jìn)樣量：5μL，流動(dòng)相：A為0.05 mol/L甲酸銨(用甲酸調(diào)節(jié)pH=4.00)，B為乙腈，A∶B=10∶90等度洗脫，紫外二極管陣列檢測器測試235 nm波長處吸收。

1.4 前處理?xiàng)l件精密量取 1.00 mL樣品置于150 mL分液漏斗中，另準(zhǔn)備10 mL石油醚將移液管上掛壁液體全部清洗轉(zhuǎn)移至該分液漏斗，加入10 mL甲醇，充分震搖1 min，靜置分層后收集下層液于50 mL容量瓶中。再次加入10 mL甲醇重復(fù)上述操作，將下層液體合并于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻。精密量取5.00 mL瓶中溶液置100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻后吸取適量過0.22 μm尼龍濾膜后裝入棕色進(jìn)樣瓶上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜系統(tǒng)適用性結(jié)果 取含青霉素 160 μg/mL、普魯卡因200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL上機(jī)測定235 nm波長處吸收，所獲色譜圖如圖1所示，其系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)如下表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該色譜條件下青霉素與普魯卡因均能滿足中國獸藥典2015年版一部通則0512高效液相色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)下相應(yīng)要求。

表1 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of the chromatographic system suitability test

(a) 對照品 Standard；(b)樣品 Sample圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 Chromatography by UPLC

2.2 線性定量范圍 取青霉素和普魯卡因?qū)φ掌愤m量，用流動(dòng)相溶解并稀釋至每1 mL中分別含青霉素1600 μg/mL和普魯卡因2160 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間溶液，用流動(dòng)相稀釋至含青霉素40、80、160、400、800 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，其中含普魯卡因分別為 54、108、216、540、1080 μg/mL。按1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測，將所得色譜圖積分面積以Y表示，進(jìn)樣濃度以X表示，所得回歸曲線如下表2所示，其線性相關(guān)系數(shù)r都大于0.999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在供試品青霉素含量40～800 mg/mL，普魯卡因含量50～1000 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好(表2)。

表2 普魯卡因青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 2 Standard curve of procaine benzylpenicillin

2.3 方法準(zhǔn)確度與精密度 精密量取取供試樣品20份，其中5份作為本底樣品直接按1.3項(xiàng)和1.4項(xiàng)方法進(jìn)行檢測獲得樣品的本底含量，剩余15份分成3批，每一批為一個(gè)添加含量水平，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，其中一批添加青霉素128 mg，普魯卡因86.4 mg；其中一批添加青霉素160 mg，普魯卡因108 mg；剩余一批添加青霉素192 mg，普魯卡因 129.6 mg,取5批樣品進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。分別按1.3項(xiàng)和1.4項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測后將結(jié)果扣除本底中的青霉素與普魯卡因含量后計(jì)算回收率，所得結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，滿足中國獸藥典2015年版一部通則9101獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中準(zhǔn)確度與精密度項(xiàng)下相關(guān)要求。

表3 方法準(zhǔn)確度與精密度Tab 3 Accuracy and precision of the method

2.4 溶解液與提取液的比較試驗(yàn)結(jié)果 嘗試了多種不同極性溶解溶液，包括純乙腈、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、正己烷和石油醚溶解樣品。分別精密量取1.00 mL樣品，以上述溶解液清洗移液管并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分別添加青霉素160 mg，普魯卡因108 mg，之后采用1.4項(xiàng)中前處理?xiàng)l件進(jìn)行凈化，測得結(jié)果如表4。比較了水、甲醇、乙腈、異丙醇的提取效率分別以上述4種提取液分次提取后稀釋定容，上機(jī)測定，測得結(jié)果如表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚在進(jìn)行溶解和轉(zhuǎn)移樣品時(shí)具有更好的溶解性且回收率最高，因此，選擇石油醚來溶解、轉(zhuǎn)移樣品和除去助劑；甲醇在進(jìn)行提取時(shí)回收率最高，因此，選擇甲醇作為提取劑。

2.5 與原藥典方法比較結(jié)果 以市售某公司實(shí)際生產(chǎn)的普魯卡因青霉素注射液產(chǎn)品(規(guī)格：10 mL：300萬單位，批號：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)為樣品，分別使用本方法與《中國獸藥典2015版一部》普魯卡因青霉素注射液含量測定項(xiàng)下方法進(jìn)行5次重復(fù)檢測后進(jìn)行比較，結(jié)果如表6所示，兩種方法所獲結(jié)果的RSD<3%，符合9101獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，結(jié)果一致。

表4 溶解液比較Tab 4 Comparison of the solution

表5 提取劑比較Tab 5 Comparison of the extract

表6 方法比較(n=5)Tab 6 Comparison of the methods (n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 溶解液與提取液的優(yōu)化過程 由于普魯卡因青霉素注射液為無菌油混懸液，其在常溫下粘度較高，移液管上的油液不易完全被轉(zhuǎn)移，原方法用稱取一定重量后測算比重，最后換算成體積的方式進(jìn)行，該方式需要用到大量樣品溶液，且由于液體黏度大比重瓶不易清洗。通過查閱相關(guān)資料可知[5-6]，普魯卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)屬于極性較大的化合物，在極性較小的溶解液中幾乎不溶，而在極性較大的有機(jī)試劑中溶解性很好，故本方法擬用足量弱極性溶劑充分溶解油液并將移液管上的油液完全清洗轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再用強(qiáng)極性提取液充分提取其中的普魯卡因青霉素后稀釋定容來解決前述問題。本研究嘗試了多種不同極性溶解溶液，包括純乙腈、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、正己烷和石油醚溶解樣品，獲得了2.4項(xiàng)中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明石油醚在進(jìn)行溶解和轉(zhuǎn)移樣品時(shí)具有更好的溶解性且回收率最高，因此選擇石油醚來溶解、轉(zhuǎn)移樣品和除去助劑。而普魯卡因和青霉素因極性較大，需用強(qiáng)極性溶劑提取后進(jìn)行測定，比較了水、甲醇、乙腈、異丙醇的提取效率，獲得了2.4項(xiàng)中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明甲醇在進(jìn)行提取時(shí)回收率最高，因此，選擇甲醇作為提取劑。

3.2 親水相互作用色譜法在分析普魯卡因和青霉素時(shí)的優(yōu)勢 親水相互作用色譜(HILIC)的保留機(jī)制比較復(fù)雜，主要有分配機(jī)制和吸附機(jī)制(包括氫鍵作用、偶極間作用等)，還涉及靜電作用和離子交換等。普魯卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)都屬于極性較大的化合物，在反相色譜柱上難以保留，因此，原藥典方法選擇氫氧化四丁基銨作為離子對試劑以加強(qiáng)對目標(biāo)化合物的保留，但使用離子對試劑對色譜柱的使用壽命和方法的耐用性具有負(fù)面影響，且不可作為液質(zhì)聯(lián)用檢測使用的流動(dòng)相，不利于方法的拓展。因此，在建立新方法時(shí)考慮到這些因素改用HILIC方法，對普魯卡因和青霉素都具有良好的保留，色譜系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)也符合藥典相應(yīng)要求[4]。另外，HILIC法進(jìn)樣溶劑一般為高比例有機(jī)試劑，這和樣品前處理中溶解液、提取液和稀釋液性質(zhì)更接近，不必像反相色譜那樣再做溶劑置換，這降低了操作中引入的誤差，有利于方法的精密度。

本研究建立了UPLC結(jié)合HILIC法測定注射液中普魯卡因和青霉素含量的方法。精密量取樣品，以石油醚充分洗滌轉(zhuǎn)移和溶解樣品，以甲醇提取后經(jīng)乙腈稀釋后進(jìn)樣測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在定量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999)，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。通過與《中國獸藥典2015版一部》普魯卡因青霉素注射液含量測定項(xiàng)下方法所測得結(jié)果的比較，結(jié)果一致。