李文輝，李 建，孫志文*

(1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京102600；2.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京100037)

泰樂菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常以酒石酸鹽、磷酸鹽的形式存在，泰樂菌素因酒石酸腸道吸收好、抗菌譜廣普遍應用于防治畜禽呼吸道、胃腸道感染等疾病，同時也可作生長促進劑。但其容易在機體或雞蛋中殘留, 即使加熱也不易分解, 間接加劇細菌耐藥性[1-3]。但畜牧業(yè)中該類藥物的濫用或違規(guī)使用易造成食品中獸藥高殘留問題，進而引起人體胃腸道的不良反應，損害耳蝸神經(jīng)，甚至造成肝腎損傷[4]。為保障食品安全和人類健康，各國政府均對動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的最大殘留限量作出規(guī)定[5-6]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年頒布的食品安全國家標準GB31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定[7]，泰樂菌素的ADI為0～30 μg/kg，在雞的肌肉、脂肪、肝臟腎臟中的最大殘留限量為100 μg/kg。近年來國內(nèi)外對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的關注逐漸增加，但對于大環(huán)內(nèi)酯類殘留檢測的研究較少，國外的檢測方法是利用毛細管氣相色譜法和紫外檢測法共同測定食品中的泰樂菌素[8]，固相萃取-液相色譜-大氣壓化學電離質譜法測定泰樂菌素殘留量[9]，國內(nèi)沒有專門檢測泰樂菌素的檢測方法，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法以液相色譜-串聯(lián)質譜法為主[10-12]，但這些方法具有前處理步驟多，效率低、檢測組織等局限，為更全面監(jiān)測雞產(chǎn)品中的泰樂菌素藥物殘留，本研究建立了一種快速高效的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法，通過對儀器分析條件，凈化方式和提取溶劑進行優(yōu)化，使所建方法能夠滿足現(xiàn)行檢測需求，充實檢測方法，對檢測方法的研究提供現(xiàn)實指導意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和耗材 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，Waters公司；XP-205電子天平，METTLER公司；24位水浴型氮吹儀，Organomation Associates公司；3-30K型冷凍離心機，Sigma公司；MS 3 basic旋渦混勻器，IKA公司；C18固相萃取柱(500 mg/6cc)，Waters公司；溶劑過濾器，美國PALL公司；超純水儀,美國Millipore公司；微量加樣器，Eppendorf 公司。

1.2 藥品和試劑 泰樂菌素標準品購自Dr公司，含量為99.5%；甲醇、乙腈為質譜純，購自賽默飛公司；氨水，分析純，購自北京化工試劑廠；所有水均為超純水。

1.3 樣品制備 試驗所采用的樣品， 來自北京市場，經(jīng)檢測無藥物殘留， 分別取雞肉、雞肝、雞腎、雞脂肪部分， 均質勻漿，置于50 mL離心管中備用。

1.4 標準溶液配制 用精度為0.01 mg的天平精密稱取泰樂菌素標準品約50 mg，于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的泰樂菌素標準儲備液；準確吸取0．1 mL標準儲備液至另一10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成10 g/mL標準工作液。

1. 5 樣品的前處理 提?。悍Q取1 g均質的組織，加入甲醇(含2%氨水)10 mL，渦旋1 min，300 r/min振蕩10 min，4000 r/min離心5 min。收集上清液，下層用甲醇(含2%氨水)10 mL重復提取1次。合并提取液，混勻，10000 r/min離心5 min。取上清液2 mL，加水15 mL?；靹?，備用。

凈化：C18固相萃取柱，依次用乙腈5 mL、甲醇5 mL、水5 mL活化平衡，取全部備用液上樣，然后用甲醇：水(35∶65，V/V)5 mL洗滌，抽干5 min，最后用5 mL甲醇：乙腈(20∶80,V/V)(含2%氨水)洗脫。收集洗脫液，35 ℃水浴氮氣吹干。加入1 mL 20%乙腈，渦旋1 min，14000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 超高效液相色譜參考條件 色譜柱：BEH C18，2.1×50 mm, 1.7 μm;流動相：A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 gradient elution conditions

1.6.2 質譜參考條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；電離電壓：3.0 kV；源溫：100 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：30 L/h；霧化氣流速：600 L/h，測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 泰樂菌素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量Tab 2 qualitative and quantitative ion and hole voltage, collision energy of Tylosin

a定量離子

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立 每種組織取5份空白樣品，按實驗操作步驟提取，洗脫液氮氣吹干后，分別移取5、10、50、100、200、400、1000 ng/mL的標準工作液各1000 μL溶解殘余物，過濾后供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線，回歸方程及相關系數(shù)見表3，從中可以看出各樣品中泰樂菌素5～1000 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

表3 線性回歸方程及相關系數(shù)Tab 3 linear regression equations and Correlation Coefficients

2.2 方法的檢出限和定量限(靈敏度) 采用空白組織中添加目標化合物的方法，依據(jù)特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3為方法檢測限，S/N≥10為方法定量限，添加適量標準溶液于1 g空白試樣中，分別制備得到4 μg/kg和10 μg/kg的添加樣品，經(jīng)前處理后檢測，在相應的保留時間，空白試樣對所測藥物無干擾，檢測限(LOD)滿足信噪比 S/N=3，定量限(LOQ)滿足信噪比S/N =10，本測定方法測得泰樂菌素在雞肉、雞肝、雞腎、雞脂肪中的檢測限為4 μg/kg，定量限為10 μg/kg。其中50 μg/kg泰樂菌素基質匹配標準溶液MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 基質匹配標準溶液MRM色譜圖(50μg/kg)Fig 1 MRM Chromatogram of Matrix matching standard solution(50μg/kg)

2.3 回收率實驗(精密度和準確度) 采用標準添加法，分別準確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標準工作溶液，使組織中泰樂菌素濃度分別為10、50、100、200 μg/kg，按上述樣品前處理方法處理后進行測定，一日內(nèi)每種藥物的每個添加濃度取5個平行樣品分別進行測定，每個添加濃度設5個平行，重復測定3 d，計算回收率和批間相對標準偏差。試驗結果表明，在10～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，在雞的不同基質中，平均添加回收率在85.9%～110.4%之間，相對標準偏差在1.2%～4.0%之間。結果表明添加回收率及相對標準偏差均滿足殘留檢測的相關要求，且方法的重現(xiàn)性很好。結果見表4。

表4 雞組織中泰樂菌素的添加回收率Tab 4 The recovery of Tylosin in chicken tissues

3 討論和結論

由于國內(nèi)外對泰樂菌素檢測方法的研究比較少，因此，可對比性不強，本研究跟國內(nèi)外文獻相比的優(yōu)勢在于，采用液相色譜串聯(lián)質譜法測定泰樂菌素采用MRM掃描方式，可以同時對母離子和子離子進行掃描，去除干擾離子，提高靈敏度和重復性。液相色譜法、毛細管氣相色譜法和紫外檢測法、固相萃取-液相色譜-大氣壓化學電離質譜法測定泰樂菌素不具備這樣的特點[3,8-9]。本研究簡化處理方法，僅需要經(jīng)過兩次甲醇提取，本試驗采用氨化甲醇跟單獨用甲醇和乙腈相比更能高效結合在C18柱上[4]，使殘留藥物更好的保留，再過C18柱凈化即可，大大縮短了檢測時間，本研究采用固相萃取技術，同液-液提取相比[11]，能更好的去除雜質，特別是基質復雜的組織，C18柱跟HLB萃取柱相比，在活化過程中不適用酸性試劑，酸性試劑會造成待測藥物的降解和破壞，而且跟國外使用復雜的耗材相比，價格適中，方便購買；使用35 ℃水浴氮吹，保護待測物不被分解。在檢測方法的適用性方面，跟國內(nèi)外檢測方法相比[4，10-12]，適應更多可食的雞組織，其他方法只能測定其他屬種或單一組織，雞組織中有很復雜的基質，單獨只檢測雞肉不能滿足檢測人員同時檢測同一屬種的多種不同組織的需求，本研究也會進一步加大適應多種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法的研究，以滿足更多藥物高通量的檢測需求。

本研究建立的雞組織中泰樂菌素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，采用基質匹配外標法進行定量，樣品經(jīng)提取、凈化處理等有效的降低了基質干擾，方法具有較高的靈敏度，通過優(yōu)化前處理方法獲得了良好的回收率，具有高效、準確的特點，本方法的檢出限、定量限、回收率、線性、RSD值等指標均能滿足檢測要求，適用于雞組織中泰樂菌素的測定。