孟慶艷　王文穎　韋柳仲　王怡然　張欣欣　孫閻

摘 要：為揭示龍膽不同器官中可溶性糖和龍膽苦苷的積累規(guī)律，采用蒽酮試劑比色法和高效液相色譜法測(cè)定其可溶性糖和龍膽苦苷在不同生長(zhǎng)時(shí)期的含量。結(jié)果表明：龍膽不同器官中的可溶性糖和龍膽苦苷隨植株發(fā)育節(jié)律而波動(dòng)。地下器官中可溶性糖含量明顯高于地上器官，在整個(gè)生長(zhǎng)季基本呈逐漸升高的趨勢(shì)，休眠期達(dá)到較高峰值。莖中的可溶性糖含量逐漸下降并基本趨于平穩(wěn);葉中可溶性糖總體含量低，蕾期出現(xiàn)峰值;花中可溶性糖含量先升高后降低。根和根莖內(nèi)龍膽苦苷的含量明顯高于地上器官，在整個(gè)生育期內(nèi)一直維持較高水平，并在6月中下旬出現(xiàn)1個(gè)峰值;莖中的龍膽苦苷含量隨植株發(fā)育逐漸降低并趨于平穩(wěn);葉中的龍膽苦苷含量較低，變化平穩(wěn);花中的龍膽苦苷含量初期逐漸升高，果期開始下降。地下器官中的可溶性糖和龍膽苦苷變化有一定的相關(guān)性，結(jié)合產(chǎn)量及效益等因素，龍膽適宜的采收期應(yīng)在花果期之后。

關(guān)鍵詞：龍膽;可溶性糖;龍膽苦苷;蒽酮;高效液相

中圖分類號(hào) Q949文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）12-0022-03

Abstract： In order to reveal the accumulation rule of soluble sugar and gentiopicroside in different organs of Gentiana scabra， the content of soluble sugar and gentiopicroside in different growth periods was determined by anthrone colorimetry and the high performance liquid chromatography. The results showed that the soluble sugar and gentiopicroside in different organs fluctuated with the development rhythm of the plant. The content of soluble sugar in the underground organs was significantly higher than that in the aboveground organs， and gradually increased in the whole growing season， reaching a high peak in the dormancy period; the content of soluble sugar in the stems gradually decreased and basically stabilized; the total content of soluble sugar in the leaves was low， and the peak value appeared in the bud period; the content of soluble sugar in the flowers increased first and then decreased. The content of gentiopicroside in roots and rhizomes was significantly higher than that in aboveground organs， and maintained a high level throughout the growth period， with a peak in the middle and late June; the content of gentiopicroside in stems gradually decreased and tended to be stable with the development of plants; the content of gentiopicroside in leaves was low and stable; the content of gentiopicroside in flowers gradually increased in the early stage， and began to decline in fruit stage. There is a certain correlation between the changes of soluble sugar and gentiopicroside in the underground organs. Combined with the factors of yield and benefit， the suitable harvest time of G. scabra should be after the flowering and fruiting period.

Key words： Gentiana scabra; Soluble sugar; Gentiopicroside; Colorimetry; HPLC

龍膽（Gentiana scabra Bunge）（亦稱粗糙龍膽）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，以干燥地下器官根和根莖入藥[1]。龍膽含有苦苷類、多糖類和生物堿類等多種有效成分，具有利膽、保肝、抗過(guò)敏、抗炎、健胃等多種藥理作用[2-3]，國(guó)際上將其收載為苦味健胃劑[4]。目前對(duì)于龍膽多糖的研究進(jìn)一步表明龍膽還具有抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗氧化及抗凝血作用等[7-8]。已有研究表明龍膽中的龍膽苦苷和龍膽可溶性糖含量隨季節(jié)不同呈現(xiàn)明顯變化[9-10]，并且這2種成分之間還具有一定的關(guān)聯(lián)性，而可溶性糖的變化可能與抗寒性有關(guān)[11]。這些研究中的試驗(yàn)材料取材時(shí)間跨度較大，并且多是以栽培型龍膽為主要研究對(duì)象，而野生型龍膽有效成分積累變化規(guī)律研究知之甚少。本研究根據(jù)野外條件下龍膽發(fā)育節(jié)律進(jìn)行取材，探究其不同采收期、不同器官中可溶性糖及龍膽苦苷含量的季節(jié)性變化，以期為龍膽藥材的適時(shí)采收和地上器官開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 龍膽根據(jù)其野外條件下的發(fā)育規(guī)律進(jìn)行采樣，采樣地點(diǎn)位于黑龍江省鶴崗市周邊林區(qū)，植株開始萌動(dòng)即取材，采樣時(shí)間間隔大約15d。每次挖取10棵發(fā)育良好的植株，采樣后及時(shí)帶回處理，并按不同部位進(jìn)行分割，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)后室溫陰干，成分測(cè)定時(shí)混合同類材料，研磨后過(guò)40目樣品篩，所得根粉備用。

1.2 儀器和試劑 Waters-1525高效液相色譜儀（2487紫外檢測(cè)器，Code 5CH柱溫箱，Empower Pro工作站），TDL-5離心機(jī)（上海安亭），CP224S型電子天平（德國(guó)賽多利斯），恒溫水浴鍋（上海一恒），B-321型超聲波清洗器（Branson Cleaning Equipment USA）。分光光度計(jì)（上海精密科）。龍膽苦苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇為色譜純（美國(guó)迪馬公司），其它試劑均為分析純（天津科密歐），水為超純水（自制）。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 可溶性糖含量 可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮試劑比色法進(jìn)行，具體參照《物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[12]所載方法提取和測(cè)定。

1.3.2 龍膽苦苷含量 采用高效液相色譜法測(cè)定龍膽苦苷的含量，具體參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行。

色譜條件：Nova-Pak C18色譜柱（3.9mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇∶水（25∶75），流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，檢測(cè)時(shí)間為5min，進(jìn)樣量5μL。

對(duì)照品溶液制備：龍膽苦苷對(duì)照品精密稱取5.0mg，置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇溶液溶解并定容，搖勻，制成濃度為0.50mg/mL的對(duì)照品溶液。

樣品溶液的制備：藥材根粉精密稱取50mg，置于50mL容量瓶?jī)?nèi)，加入45mL的70%乙醇，在10℃條件下超聲提取55min，再用70%乙醇定容，混勻后取約5mL置于離心管內(nèi)，離心15min（2500rpm/min），取上清液1mL置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻并過(guò)濾（0.45μm濾膜），制得樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖含量的變化 按年發(fā)育節(jié)律龍膽不同器官可溶性糖含量變化如圖1所示。不同器官中可溶性糖含量差異較大，根和根莖中的含量最高，其變化幅度為20.49%～40.55%，整個(gè)生育期內(nèi)呈逐級(jí)升高的變化趨勢(shì)，并在花果期維持較高的水平。地上莖中可溶性糖含量變化幅度為9.34%～17.12%，整個(gè)生育期內(nèi)呈先降低后趨于平穩(wěn)并小幅度升高至枯萎期。葉片中可溶性糖的含量較低，變化幅度為4.38%～10.91%，整個(gè)生育期內(nèi)波動(dòng)不明顯;繁殖器官花中可溶性糖的變化幅度為3.18%～13.91%，呈先升高后降低的趨勢(shì)。計(jì)算龍膽根和根莖、莖、葉、花（果）各器官中可溶性糖的平均含量依次為32.94%、12.22%、6.45%、9.62%，以根和根莖中的可溶性糖含量最高，其次是莖、花（果），最后是葉片。根和根莖為多年生，每年積累和轉(zhuǎn)化一定的光合產(chǎn)物，是可溶性糖的供應(yīng)和儲(chǔ)存的主要部位，各器官中可溶性糖的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)也有內(nèi)在的必然聯(lián)系。

2.2 龍膽苦苷含量的變化 植株中龍膽苦苷含量年發(fā)育節(jié)律內(nèi)呈現(xiàn)一定的波動(dòng)（圖2）。根和根莖中的含量最高，其變化幅度為5.31%～8.62%，年生長(zhǎng)期內(nèi)苦苷含量出現(xiàn)3個(gè)高峰，分別出現(xiàn)在6月15日、9月11日和10月4日。并且在6月中下旬一直維持較高的水平，花蕾期降至較低水平，之后小幅度波動(dòng)，至果實(shí)發(fā)育期降至較低點(diǎn)6.12%，至休眠期又小幅度升高。從春天到秋天的整個(gè)生育期內(nèi)，根和根莖內(nèi)的龍膽苦苷含量一直維持在較高的水平，說(shuō)明該地區(qū)的龍膽具有較高的內(nèi)在質(zhì)量。地上莖中龍膽苦苷含量變化幅度較大，為0.39%～2.19%，萌動(dòng)期苦苷含量較高，之后隨著植株的發(fā)育呈下降趨勢(shì)并維持較低水平至植株枯萎。葉片中的龍膽苦苷含量很低，基本維持在0.2%的水平，整個(gè)發(fā)育期波動(dòng)不明顯?；ㄖ旋埬懣嘬蘸砍跗谳^低，雖逐漸升高，但仍較低，維持在0.23%～0.38%的水平。計(jì)算龍膽不同器官中龍膽苦苷含量的平均值可知：根和根莖為7.07%，莖為0.83%，葉為0.19%，花（果）為0.29%。可以看出，根和根莖苦苷含量最高，其次是莖、花，最后是葉，整個(gè)生育期內(nèi)龍膽地下器官龍膽苦苷含量明顯高于地上器官。

3 討論與結(jié)論

龍膽中可溶性糖含量隨著植株的發(fā)育而出現(xiàn)一定程度的波動(dòng)，除了環(huán)境條件的影響外，這與植株的萌動(dòng)、后續(xù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、孕蕾、開花以及果實(shí)發(fā)育相聯(lián)系。整個(gè)生育期內(nèi)根和根莖中可溶性糖含量明顯高于地上部分，說(shuō)明地下根和根莖是龍膽可溶性糖積累的主要部位，并且在其休眠期可溶性糖含量達(dá)到較高水平，這主要是為了越冬而做準(zhǔn)備，進(jìn)一步說(shuō)明可溶性糖與植物的抗寒性有關(guān)[11，14]。

龍膽苦苷在根和根莖內(nèi)部的積累隨植株發(fā)育狀態(tài)而呈現(xiàn)一定的變化，變動(dòng)幅度為5.31%～8.62%，苦苷含量整體水平較高，說(shuō)明龍膽藥材質(zhì)量?jī)?yōu)異，體現(xiàn)了其道地性的優(yōu)勢(shì)。藥材采收時(shí)，藥材質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益需要同時(shí)兼顧[15]。龍膽苦苷含量在6月中下旬雖然出現(xiàn)了峰值，但此時(shí)的龍膽正處于營(yíng)養(yǎng)發(fā)育期，植株折干率較低，加之此時(shí)可溶性糖含量較高（藥材吸水變軟[11]而存儲(chǔ)不便）， 此時(shí)采收主要會(huì)影響藥材的產(chǎn)量。所以結(jié)合產(chǎn)量及效益等因素，適宜的采收期應(yīng)在花果期之后，霜降之前，以保證其質(zhì)量和產(chǎn)量。

龍膽根和根莖是可溶性糖和苦苷積累最多的器官，2種成分在地下器官中的動(dòng)態(tài)變化基本呈負(fù)相關(guān)性，從植株萌動(dòng)到開花前期更為明顯，說(shuō)明此時(shí)期的可溶性糖和龍膽苦苷能夠相互轉(zhuǎn)化，這可能與植株的萌動(dòng)和孕蕾有關(guān)。已有資料也驗(yàn)證了兩者的轉(zhuǎn)化關(guān)系[11，16]，但具體的變化規(guī)律還有待進(jìn)一步探究。

另外，龍膽在采收時(shí)，地上器官往往作為秸稈被廢棄，而地上器官中均含有一定量的可溶性糖和苦苷成分，地上部分仍是一個(gè)亟待研究綜合利用的問題。如果將地上部分在開花初期采收（此時(shí)產(chǎn)量與質(zhì)量也均接近峰值）不僅避免果實(shí)成熟時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的過(guò)分消耗，而且可以收獲用作健胃茶原料的綠色莖葉并伴有大量花蕾的材料，這一設(shè)想還需通過(guò)后續(xù)研究和生產(chǎn)實(shí)踐來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2015版一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]劉占文，陳長(zhǎng)勛，金若敏，等.龍膽苦苷的保肝作用研究[J].中草藥，2002，33（1）：47-50.

[3]李生浩，李俊義，武昆利，等.龍膽苦苷的藥理作用及分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，（1）：158-162.

[4]R Kakuda， T Iijima， Y Yaoita， et al. Triterpenoids from Gentiana scabra [J]. Phytochemistry，2002，59（8）：791-794.

[5]Li J，Guo W J，Yang Q Y.Effects of ursolic acid and oleanolic acid on human colon carcinoma cell line HCT15[J].World Journal Gastroenterol，2002，8（3）：493-495.

[6]毛小明，李辛鷗.中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用研究近況[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2001，15（3）：48-49.

[7]程振玉，于麗穎，吉惠杰，等.龍膽多糖的不同提取工藝及抗氧化活性研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2016（37）：81-86.

[8]江蔚新，趙璽.龍膽多糖的抗凝血作用的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2008，21（5）：31-32.

[9]蔣品，高言明，楊玉琴，等.龍膽不同采收期龍膽苦苷和多糖含量變化研究[J].江西中醫(yī)藥，2011，42（338）：55-57.

[10]劉桓宇，朱玉野，張春紅，等.不同產(chǎn)地龍膽多糖含量的比較[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2007（6）：18-20.

[11]關(guān)旸，王臣，王曄.粗糙龍膽地下器官龍膽苦苷和可溶性糖含量的動(dòng)態(tài)研究[J].植物研究，2004，24（3）：366-368.

[12]上海植物生理學(xué).植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[S].上海：上海科技業(yè)版社，1999.

[13]張?zhí)m蘭，張欣欣，孫閻.三花龍膽不同器官可溶性糖和龍膽苦苷含量的動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（9）：78-83.

[14]尹衛(wèi)，楊國(guó)柱，李小安，等.紫花苜蓿4個(gè)生理指標(biāo)在冬季自然條件下的變化規(guī)律研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（3）：93-96，99.

[15]劉鳴遠(yuǎn)，王棟，都曉偉.根類藥材植物生物學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1995.

[16]江蔚新，任雪峰，陳風(fēng)雨，等.三花龍膽地上、地下器官成分積累規(guī)律研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004（1）：25-26.

（責(zé)編：施婷婷）