李熙晨　吳垠　李曉東　汪濤

摘要：為了研究金屬離子銅、鎳對(duì)海帶生長(zhǎng)及相關(guān)生理指標(biāo)變化的影響，對(duì)不同濃度金屬離子進(jìn)行7 d的海帶室內(nèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。對(duì)其生長(zhǎng)情況、金屬離子吸附、可溶性糖、蛋白含量、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，海帶對(duì)Cu²⁺的敏感度高于Ni²⁺，在Cu²⁺的作用下，海帶的生長(zhǎng)受到明顯的抑制作用，出現(xiàn)厚度變薄、甚至腐爛等癥狀。低濃度的Ni²⁺能促進(jìn)海帶可溶性糖的合成，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)則抑制，Ni²⁺對(duì)實(shí)驗(yàn)藻海帶蛋白含量無(wú)明顯影響。而在對(duì)兩種金屬離子的吸附方面，海帶對(duì)Cu²⁺的吸附量遠(yuǎn)大于對(duì)Ni²⁺的吸附量。

關(guān)鍵詞：海帶；銅離子；鎳離子；吸附；蛋白、可溶性糖

海帶（Laminaria japonica）是我國(guó)海水養(yǎng)殖的主要大型藻類(lèi)之一，是北方地區(qū)傳統(tǒng)的養(yǎng)殖對(duì)象。海帶作為人們餐桌上的美食，具有補(bǔ)充活性碘、降低血膽固醇、軟化血管、緩解高血壓、抗腫瘤、抗輻射、提高免疫力等獨(dú)特的醫(yī)療保健作用。同時(shí)海帶還是制碘、生產(chǎn)甘露醇和褐藻膠的重要工業(yè)原料。但是隨著工業(yè)的發(fā)展，大量重金屬以各種途徑排入土壤和天然水環(huán)境中，使水體產(chǎn)生嚴(yán)重污染。研究顯示，當(dāng)水環(huán)境中的Hg、Cd、Ni、Pb等重金屬離子濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)代謝有抑制作用，畸變?cè)孱?lèi)的細(xì)胞形態(tài)，阻止細(xì)胞分裂，破壞細(xì)胞內(nèi)含物，降低酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致藻類(lèi)的死亡。近年來(lái)一些海區(qū)養(yǎng)殖的海帶發(fā)生大規(guī)模腐爛死亡現(xiàn)象，究其原因包括生態(tài)因子變化、病害等，許多研究工作者對(duì)海帶潰爛死亡問(wèn)題的研究主要集中在以微生物病原菌感染后海帶的變化方面。而對(duì)重金屬污染導(dǎo)致海帶生理變化方面的研究尚缺乏系統(tǒng)研究。本文在實(shí)驗(yàn)生態(tài)條件下，選取兩種重金屬銅和鎳離子，分析其對(duì)海帶生長(zhǎng)、富集及相關(guān)生理指標(biāo)的影響，為重金屬的生態(tài)毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藻體

實(shí)驗(yàn)用海帶采自大連市金州登沙河灣海域，將生長(zhǎng)正常、結(jié)構(gòu)完整海帶30株低溫條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

取容積為180 L的水槽10個(gè)，加入已經(jīng)過(guò)濾好的海水，按順序編號(hào)，將從實(shí)驗(yàn)海域采集的海帶依次放入水槽中，放入前測(cè)定海帶長(zhǎng)度和濕重。在充氣情況下暫養(yǎng)兩天。

重金屬Cu²⁺和Ni²⁺采用硫酸銅和氯化鎳的鹽溶液，由低到高依次加入到暫養(yǎng)海帶的水槽中，使兩種金屬離子形成5個(gè)濃度梯度，分別是0、0.25、0.5、1、5 mg/L。培養(yǎng)24 h后，觀(guān)察海帶性狀并記錄，同時(shí)更換新的海水并加入同等藥品，重復(fù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為7 d。養(yǎng)殖過(guò)程中水溫為4.5～5.0℃，光照2 000～5 000 1x，氨氮≤0.2 mg/L，24 h充氣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量海帶的長(zhǎng)度和濕重，并取樣品測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3生長(zhǎng)及生理指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定之前，先用純水將樣品沖洗干凈，然后用吸水紙擦干表面水分，之后裁剪并稱(chēng)重。

1.3.1海帶中重金屬含量的檢測(cè) 參照國(guó)標(biāo)GB/T5009.13—2003、GB/T5009.17—2003的測(cè)定方法，采用石墨爐原子吸收光度計(jì)，微波消解儀，原子熒光光度計(jì)等。

1.3.2海帶可溶性糖、蛋白含量的測(cè)定采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖，采用考馬斯亮蘭法測(cè)定可溶性蛋白。

1.3.3總抗氧化能力和超氧化物岐化酶（SOD）活性測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)定的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan多重比較法比較各組間平均值的差異顯著性，以P<0.05為顯著性差異。

2結(jié)果

2.1生長(zhǎng)和形態(tài)變化

表1為不同濃度的鎳離子和銅離子對(duì)海帶生長(zhǎng)的影響。由表1可以看出，與對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)的鎳離子濃度范圍內(nèi)，各組海帶的增長(zhǎng)率無(wú)明顯差異（P>0.05），增重率差異顯著（P<0.05），0.50 mg/L實(shí)驗(yàn)組海帶的增重率和增長(zhǎng)率均高于對(duì)照組；而銅離子對(duì)海帶生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，空白組海帶與4個(gè)實(shí)驗(yàn)組海帶增長(zhǎng)率均差異顯著（P<0.05），1.0和5.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組海帶增重率與前三組變化差異顯著（P<0.05）。

海帶形態(tài)變化顯示，添加不同濃度銅離子的海帶表面，陸續(xù)出現(xiàn)厚度變薄、局部腐爛的現(xiàn)象，濃度越高現(xiàn)象越明顯。添加鎳離子的海帶表觀(guān)形態(tài)方面未見(jiàn)明顯變化。

2.2海帶對(duì)兩種金屬離子的吸附

如圖1、2所示隨著Cu2+、Ni2+濃度的升高，海帶對(duì)于兩種離子的吸附均為遞增趨勢(shì)，在1.00mg/L到5.00 mg/L時(shí)變化最為顯著（P<0.05），且在5.00 mg/L時(shí)為最高。兩者比較海帶對(duì)CC+的吸附性更強(qiáng)。

2.3可溶性糖含量的變化

從圖3可以看出，銅離子對(duì)海帶的影響隨濃度的升高呈現(xiàn)遞減的狀態(tài)。Cu²⁺在0.25 mg/L時(shí)下降最顯著。而Ni²⁺對(duì)海帶糖含量的影響與銅離子不同，呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，在0.50mg/L和1.00 mg/L時(shí)顯著上升（P<0.05）。

2.4可溶性蛋白的含量變化

從圖4可以看出Cu²⁺對(duì)海帶蛋白影響的趨勢(shì)是隨濃度的升高總體先上升后下降，并在濃度為0.25 mg/L時(shí)顯著上升（P<0.05），以后隨著濃度的上升顯著下降（P<0.05）。Ni²⁺對(duì)海帶的影響呈總體上升的趨勢(shì)，但上升均不顯著（P>0.05）。

2.5總抗氧化力能力的變化

如圖5所示銅離子和鎳離子對(duì)海帶總抗氧化力的影響趨勢(shì)不同，在銅離子作用下海帶的總抗氧化力表現(xiàn)為先下降再升高，且變化均不顯著（P>0.05）；而在鎳離子的作用下海帶總抗氧化力表現(xiàn)為先升高再降低，0.25和0.50 mg/L時(shí)上升最顯著（P<0.05），當(dāng)濃度高于0.50 mg/L，總抗氧化力與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。

2.6 SOD含量的變化

從圖6可以看出不同濃度Cu²⁺對(duì)海帶SOD的影響隨濃度的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，在0.25、0.50 mg/L時(shí)下降最為顯著（P<0.05）。而Ni2+在濃度0.25、1.00、5.00 mg/L時(shí)對(duì)海帶SOD的影響為上升，但不顯著（P>0.05），但在0.5 mg/L時(shí)顯著下降（P<0.05）。

3討論

在已研究過(guò)的金屬中，Cu起著雙重作用，少量的Cu是藻類(lèi)代謝過(guò)程中的必需品，但高濃度的Cu對(duì)藻類(lèi)具有毒害作用，Cu是一種細(xì)胞代謝抑制劑。Ni同樣能被藻類(lèi)積累，有研究表明Ni對(duì)纖維藻細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，Ni能與氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA和RNA相結(jié)合，阻礙細(xì)胞的分裂，破壞DNA的結(jié)構(gòu)。姜彬慧、林碧琴的研究表明，當(dāng)Ni濃度≥0.4 mg/L時(shí)，藻類(lèi)生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)濃度為3.2 mg/L時(shí)，其蛋白質(zhì)和氨基酸的含量明顯下降?？追毕鑼?duì)不同濃度的Ni²⁺對(duì)羊角月芽藻的生長(zhǎng)速度、蛋白質(zhì)含量、ATP水平、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）、酸性磷酸酶及硝酸還原酶活性的影響試驗(yàn)，研究表明，在所試濃度范圍內(nèi)Ni對(duì)羊角月芽藻的生長(zhǎng)速度有抑制作用，但單位藻培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)隨著Ni2+濃度的增加而增加，同時(shí)高濃度的Ni2+對(duì)酶的活性有明顯抑制作用，藻細(xì)胞中ATP水平隨著濃度的增加而下降，說(shuō)明重金屬離子的存在會(huì)改變?cè)寮?xì)胞內(nèi)能量的代謝。

糖類(lèi)和蛋白是生物體的基礎(chǔ)代謝物，對(duì)植物的生長(zhǎng)、生理活動(dòng)有重要影響。根據(jù)研究，植物的病害與體內(nèi)可溶性糖含量有一定關(guān)系。吳海燕等報(bào)道水稻感染小球菌核病菌后植株體內(nèi)可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)，同時(shí)在海帶病爛過(guò)程中，隨褐藻酸降解菌數(shù)量的增多，海帶的呼吸作用增強(qiáng)，糖的利用速率加快，導(dǎo)致糖含量降低。在本實(shí)驗(yàn)中Cu²⁺感染過(guò)的海帶發(fā)生腐爛，隨著病爛的嚴(yán)重可溶性糖含量逐漸降低，而沒(méi)有發(fā)生病爛的Ni²⁺組海帶沒(méi)有這種現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)中，Cu²⁺組可溶性蛋白的含量在低濃度下先有小幅升高，然后逐漸下降，這與王海河等對(duì)病毒侵染煙草后可溶性蛋白含量變化的研究結(jié)果相似，可溶性蛋白含量的升高可能是由于海帶對(duì)重金屬的侵染作出了積極反應(yīng)，體內(nèi)產(chǎn)生一些抗性蛋白，這也導(dǎo)致了蛋白含量有所升高。而隨著離子濃度和病爛情況的加重，海帶的防御能力遭到破壞，抑制蛋白質(zhì)合成，加速蛋白質(zhì)的分解，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，破壞蛋白質(zhì)分子，從而使可溶性蛋白含量降低。

在逆境脅迫下，植物體活性氧的產(chǎn)生能力會(huì)強(qiáng)于清除能力。重金屬離子脅迫與其他形式的氧化脅迫是相似的，某些活性氧可以充當(dāng)信號(hào)分子，在重金屬感染后傳遞信號(hào)，從而使植物組織產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道屏障，具有維持活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)生病爛的高濃度Cu²⁺感染下可見(jiàn)，在海帶抗病反應(yīng)中SOD起重要的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，海帶在高濃度Cu²⁺的脅迫下發(fā)生病爛，SOD逐漸升高。在Ni²⁺脅迫下未發(fā)生病爛，SOD變化不顯著。本實(shí)驗(yàn)表明高濃度Cu²⁺對(duì)海帶的毒性作用大于Ni²⁺。