藍(lán)?！?yīng)華　蘇云順　王馨嫻　趙謙　尹革芬

摘? 要：為了解云南省豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）流行毒株E2基因的遺傳變異情況，試驗采用RT-PCR檢測云南省疑似豬瘟陽性樣品，并獲取4株E2全基因序列。對所獲的E2基因序列與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化樹比對分析。結(jié)果表明，獲得4條全長均為1 119 bp的云南省CSFV流行毒株E2全基因序列。4株云南毒株序列的同源性為81.7%～99.6%，與疫苗毒株的同源性為81.3%～94.5%，與其他參考序列的同源性為81.8%～99.6%。遺傳進(jìn)化分析表明，4株云南流行毒株分為兩個不同的進(jìn)化分支，1株流行毒株和疫苗毒株同屬于1.1基因亞型，其他3株流行毒株分布在另一進(jìn)化分支上，屬于2.1c基因亞型，研究結(jié)果為云南地區(qū)豬瘟的防控提供了一定的理論參考。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒;E2基因;遺傳變異

中圖分類號：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2020）06-0032-06

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起豬的一種病毒性疾病，具有傳染性高和傳播范圍廣的特征，嚴(yán)重時發(fā)病劇烈、高燒不退甚至伴有全身敗血性癥狀，世界各地都有流行，是國際獸疫局要求必須上報的疾病之一，也是豬病中危害性最大且重視程度最高的動物傳染性疾病之一[1]。

CSFV只有一個血清型。根據(jù)5非編碼區(qū)、E2基因和NS5B聚合酶基因的序列數(shù)據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，CSFV分為三種基因型：1型、2型和3型，每種基因型進(jìn)一步分為3個或4個基因亞型。其中CSFV基因亞型2.1在國內(nèi)外流行最廣，并被進(jìn)一步分為CSFV基因亞型2.1a、CSFV基因亞型2.1b和CSFV基因亞型2.1c[2]。CSFV的四種基因亞型（1.1、2.1、2.2和2.3）在我國廣泛流行，其中CSFV基因亞型2.1b在過去10年中逐漸成為我國主要的流行毒株。本研究通過調(diào)查云南省CSFV流行株E2基因的遺傳變異，分析云南省部分地區(qū)CSFV流行毒株與疫苗毒株的突變情況，為豬瘟防治提供合理科學(xué)的理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 樣品及疫苗

本試驗樣品為2018年云南省各地區(qū)豬場200份疑似豬瘟的送檢樣品，通過RT-RCR得到4個來自楚雄州某豬場、紅河州某豬場和曲靖市某豬場病豬的淋巴結(jié)、腎臟和脾臟等陽性樣品;新溫必沙豬瘟活疫苗購自吉林和元生物工程股份有限公司。

1.2? 試驗試劑

RNAiso Plus、DL2000 Marker和EcoR I限制酶購自寶生物工程（大連）有限公司;Easy First-Strand cDNA SuperMix和2×TransTag HIFI Mix II（-dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖購自白賽勤化學(xué)技術(shù)有限公司;pClone007 Vector Kit和TreliefTM 5α Chemically Competent Cell購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物來源

擴(kuò)增CSFV E2全基因引物參照文獻(xiàn)獲取和合成[3]，引物信息如表1所示。

1.4 CSFV E2全基因擴(kuò)增

按照RNAiso Plus試劑盒說明書處理樣品和提取核酸。將提取的RNA按照2×ES Reaction Mix 5 μL、EasyscriptTM RT/RI Emzyme Mix 0.5 μL、下游引物? ? ? 1 μL和模板RNA 3.5 μL的反應(yīng)體系以及? ? 42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。CSFV E2基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Trans HiFiII 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL和cDNA 1.0 μL，反應(yīng)體系為? ? ? 25 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s和72 ℃ 40 s，循環(huán)35次;72 ℃ 5 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 CFSV E2全基因分子克隆

將1.3.2中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pClone007載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TrelieTM 5α中，連接轉(zhuǎn)化具體操作步驟按照pClone007 Vector Kit和TreliefTM 5α Chemically Competent Cell試劑盒說明書進(jìn)行。搖菌后按照試劑盒操作說明書提取重組質(zhì)粒。

1.6 質(zhì)粒酶切鑒定及測序

37 ℃水浴鍋中用EcoR I限制酶單酶切質(zhì)粒1 h～3 h，接著用1.5%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定（酶切位點信息如表2所示），最后將鑒定正確的質(zhì)粒送去測序。酶切體系：EcoR I限制酶1 μL、10×緩沖液2 μL、DEPC 16 μL、質(zhì)粒? 1 μL，總反應(yīng)體系20 μL。

1.7 基因同源性比較和遺傳進(jìn)化樹分析

利用Megalign軟件比較本試驗獲取的流行毒株與GeneBank基因庫中參考毒株E2全基因序列的同源性，建立遺傳進(jìn)化樹對遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，參考毒株序列信息如表3所示。

2? 結(jié)果

2.1 CFSV E2全基因PCR擴(kuò)增

利用CFSV E2基因引物擴(kuò)增云南省4個地區(qū)病豬的CFSV陽性組織樣品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，得到與預(yù)期片段大?。? 343 bp）相符的條帶（圖1）。

2.2 CSFV E2全基因目的片段的純化

PCR擴(kuò)增目的基因并通過1%瓊脂糖凝膠電泳富集PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示目的片段大小為1 343 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。根據(jù)膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行目的片段回收，回收產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。

2.3 CSFV E2目的片段酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒用EcoR I限制酶進(jìn)行單酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切結(jié)果出現(xiàn)1 408 bp和1 846 bp兩個片段，其中目的片段約為1 408 bp，與預(yù)期相符，見圖4。

2.4 CSFV E2全基因序列同源性分析

本次試驗將云南省不同地區(qū)獲得的4株CSFV云南流行毒株分別命名為YN-QJ、YN-HH、YN-HH2和YN-CX，疫苗毒株命名為YM-2，具體信息見表4。用DNA Star 6.0中Editseq、Seqman以及Megalign離線軟件對4株CSFV流行毒株的E2基因序列、1株疫苗毒株序列和17株參考序列進(jìn)行比對分析，可知同源性為81.8%～99.6%，表明E2基因同源性存在較大差異，4株CSFV流行毒株間的基因同源性為81.7%～99.6%，與疫苗毒株同源性為81.3%～94.5%，見圖5。

2.5 CSFV E2基因遺傳進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析CSFV云南地方流行毒株與CSFV國內(nèi)外分離株基因組之間的親緣關(guān)系，用GenBank中獲取的17株CSFV國內(nèi)外參考毒株與4株CSFV云南地方流行毒株的E2基因序列構(gòu)建基因遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示本試驗獲得的4株CSFV云南流行毒株和疫苗毒株屬于1亞群和2亞群，主要分布在2.1分支和1.1分支上，而2.1亞型主要以2.1c為主。流行毒株YN-HH、YN-HH2和YN-CX分布在CSFV的2.1c基因亞型分支上，而毒株YN-QJ和疫苗毒株YM-2的親緣關(guān)系較近，均分布于CSFV的1.1基因亞型，并未發(fā)現(xiàn)CSFV的其他基因型或基因亞型（2.2亞型、2.3亞型和基因3型）的毒株，遺傳進(jìn)化樹見圖6。

3? 討論

E2基因是CSFV基因組中最容易發(fā)生變異的區(qū)域，使CSFV更能適應(yīng)環(huán)境的變化。這種變異性直觀地反映了CSFV流行毒株關(guān)鍵抗原表位的變異，這也是導(dǎo)致疫苗接種失效的原因之一。該基因的2 508～2 697位核苷酸序列（190 bp）是公認(rèn)用于分析CSFV的遺傳變異的片段之一，具有最好的鑒別能力和最高的置信度，它能區(qū)分核苷酸差異很小的毒株。因此，該片段普遍用于CSFV的多樣性分析。E2基因的分析結(jié)果不僅可反映毒株的遺傳關(guān)系，還關(guān)聯(lián)著毒株間的免疫關(guān)系。此外，CSFV的中和性抗原表位都位于gp55囊膜糖蛋白上，該蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)，參與病毒感染細(xì)胞的過程，因此E2基因在CSFV分子流行病學(xué)研究中備受重視。

20世紀(jì)40年代分離到的石門毒株與70～80年代分離到的HeNZZ1/82毒株以及90年代分離到的BJCY1/96、BJTX3/96和GDGZ1/95毒株的E2基因同源性高達(dá)99.1%，說明E2基因的高變區(qū)在某種程度上呈現(xiàn)一定的穩(wěn)定性;20世紀(jì)90年代分離到的3株毒株HeBHH1/95株、HeNXH2/98株和GHBH1/98株與豬瘟兔化弱毒C株的核苷酸的同源性均為100%，這表明CSFV流行株的E2變異呈現(xiàn)一定的多樣性，向遠(yuǎn)離疫苗株的方向發(fā)生變異[4]。2006—2007年遼寧省CSFV流行毒株已經(jīng)從基因1型向基因2型轉(zhuǎn)變，與CSFV的石門毒株和兔化弱毒株在基因序列間存在較大的差異，也在向遠(yuǎn)離疫苗毒株的方向現(xiàn)發(fā)生變化[5]。本試驗通過RT-PCR和分子克隆及測序，獲得了4株CSFV云南流行毒株和1株CSFV疫苗毒株的E2基因核苷酸序列，基因全長均為1 119 bp。將獲取的4株CSFV流行毒株與國內(nèi)外不同分型的18株CSFV參考序列進(jìn)行基因同源性比較和構(gòu)建基因遺傳進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，4株CSFV云南流行毒株間的核苷酸同源性為81.7%～99.6%;CSFV疫苗毒株與CSFV流行毒株的核苷酸同源性為81.3%～94.5%，其中3株CSFV流行毒株與CSFV疫苗毒株的同源性相對較低，表明云南省CSFV流行毒株在基因上產(chǎn)生了不同的遺傳變異?；蜻z傳進(jìn)化樹分析顯示，4株CSFV云南流行毒株中僅有1株CSFV流行毒株和CSFV疫苗毒株在一個分支上，屬于1.1基因亞型。其他3株CSFV流行毒株分布在另外一個進(jìn)化分支上，屬于2.1c基因亞型，進(jìn)一步表明在云南流行的CSFV流行毒株在遺傳上出現(xiàn)了進(jìn)化的差異。云南省不同地區(qū)當(dāng)前部分流行的CSFV呈現(xiàn)遺傳變異多樣性，這與國內(nèi)其他區(qū)域研究CSFV的變化趨勢一致[6-7]。因此，有必要長期在云南省開展CSFV的分子流行病學(xué)調(diào)查，為豬瘟的防控提供理論和技術(shù)參考。

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