甘維 朱柔霖 劉雪萍

[摘要] 目的 探討富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在兔椎間關(guān)節(jié)融合中的應(yīng)用效果。 方法 選取健康10周齡的新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機(jī)取新西蘭大白兔24只，設(shè)為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經(jīng)前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術(shù)，建立新西蘭大白兔動物模型。建模成功后隨機(jī)分為1組（n=24）、2組（n=24）、3組（n=24）。1組建模成功后不采取任何措施處理，常規(guī)飲食、飲水;2組給予纖維蛋白膠、骨形態(tài)發(fā)生蛋白干預(yù);3組在2組基礎(chǔ)上聯(lián)合富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)，比較四組大白兔第12周時階段活動程度、四組大白兔椎體后緣高度丟失情況、椎間關(guān)節(jié)融合情況、X線側(cè)位片上測量Cobb角情況。 結(jié)果 1組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度相比，無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度最差;四組大白兔椎體后緣高度丟失情況相比，無明顯差異（P>0.05）;1組椎間關(guān)節(jié)融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)融合分級最差;四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論 兔椎間關(guān)節(jié)融合中，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植效果顯著，可以有效促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)融合，應(yīng)在臨床上廣泛推廣與應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞;兔椎間關(guān)節(jié)融合;骨形態(tài)發(fā)生蛋白;纖維蛋白膠;椎體后緣高度

[中圖分類號] R687.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）13-0031-05

[Abstract] Objective To explore the application effect of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells in the rabbit intervertebral joint fusion. Methods Ninety-six healthy New Zealand rabbits aged 10 weeks were selected of either sex. Twenty-four New Zealand rabbits were randomly selected as the blank control group（group 4）. The remaining 72 New Zealand rabbits were given extraperitoneal lumbar discectomy and spinal fusion via the anterior approach， and the animal model of New Zealand rabbits was established. Those rabbits were randomly divided into group 1（n=24）， group 2（n=24） and group 3（n=24） after modeling. No intervention was given to group 1 after modeling， which was fed with regular diet and drinking water; the intervention of fibrin glue and bone morphogenetic protein was given to group 2; the intervention of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells was given to group 3 on the basis of group 2. At 12 weeks， the activity level， the loss of height of vertebral posterior margin， the intervertebral joint fusion， and the measured Cobb angle on the lateral X-ray were compared in the four groups. Results The range of joint activity and the activity level in the group 1 were lower than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; there was no significant difference in the range of joint activity or the activity level between group 2 and group 3（P>0.05）; the range of joint activity and the activity level in group 4 were lower than those in the other three groups. There was no significant difference in the loss of height of vertebral posterior margin among the four groups（P>0.05）. The grade of the intervertebral joint fusion in the group 1 were higher than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; There was no significant difference in the grade of the intervertebral joint fusion between group 2 and group 3（P>0.05）; The grade of the intervertebral joint fusion in group 4 was lower than that in the other three groups. There was no significant difference in the Cobb angle among the four groups（P>0.05）. Conclusion In the rabbit intervertebral joint fusion， the transplantation of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells has significant effect and can effectively promote the rabbit intervertebral joint fusion， which should be widely popularized and applied in clinical medicine.

[Key words] Enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells; Rabbit intervertebral joint fusion; Bone morphogenetic protein; Fibrin glue; Height of vertebral posterior margin

脊柱融合術(shù)在臨床上是治療脊柱畸形、椎體滑脫、脊柱退變性疾病的常用方法。融合材料一般為人工骨、自體骨、異體骨[1]。植入的這些材料體積較大，需要對機(jī)體組織進(jìn)行破壞才能獲得較好的手術(shù)視野，且術(shù)后并發(fā)癥較多，治療費(fèi)用偏高。因此，尋找更加安全、有效、生物活性高的植骨替代材料非常重要。自體髂骨移植是臨床上進(jìn)行脊柱融合的首選方法，但是，有5%～35%的患者會發(fā)生單節(jié)段脊柱不融合現(xiàn)象，多節(jié)段脊柱融合骨不連發(fā)生率也非常高，同時，會有30%的患者發(fā)生神經(jīng)損傷、切口感染、血腫、疼痛等癥狀，這會延長手術(shù)時間、增加出血量[2]。有相關(guān)研究顯示，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)過骨形態(tài)發(fā)生蛋白的誘導(dǎo)可以產(chǎn)生成骨細(xì)胞[3]。我院在兔椎間關(guān)節(jié)融合研究中，使用富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）進(jìn)行移植，效果顯著，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取健康10周齡的新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機(jī)取新西蘭大白兔24只，設(shè)為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經(jīng)前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術(shù)，建立新西蘭大白兔動物模型。建模成功后隨機(jī)分為1組（n=24）、2組（n=24）、3組（n=24）。新西蘭大白兔96只，體重1.5～2.5 kg，平均（1.96±0.22）kg;動物許可證號：SYXK（粵）2019-0201，所選動物均由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供雄性C57BL/6小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。

1.2 儀器與設(shè)備

無菌液態(tài)bBMP：廣州陸軍總院;凝血酶抑肽酶、纖維蛋白原：哈爾濱翰邦公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）：美國Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、bBMP、FG復(fù)合載體及富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、FG復(fù)合物制備? （1）bBMP、FG復(fù)合載體制備。嚴(yán)格無菌條件下將液態(tài)bBMP溶液、混合纖維蛋白膠溶液加入纖維蛋白膠抑胰肽酶溶液中聚合而成的FG，最終的bBMP濃度：20 ms/mL，將FG注射到24支無菌離心管內(nèi)，放置在4℃條件下進(jìn)行保存[6]。另外再取24支離心管，在其中加入FG，放置在4℃條件下保存。（2）骨髓基質(zhì)干細(xì)胞制備。對選取的每組大白兔各耳朵打孔作為標(biāo)志，將4 mL骨髓從脛骨粗隆處抽取出來，然后將S液、D-Hank液加入其中混合均勻，將細(xì)胞懸液按照1∶1.5的比例進(jìn)行密度梯度離心[4]。小心的對中間細(xì)胞層（富含有核細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞）吸取，使用D-Hank、S液對細(xì)胞進(jìn)行吹打洗滌，將分離液清除，將細(xì)胞液分為3份分別加入含有DMEM的培養(yǎng)液（10 ms/L谷胺酰胺、20%胎牛血清）中進(jìn)行培養(yǎng)，1周后換溶液，之后定期更換，每3天1次，直到整個培養(yǎng)孔底面鋪滿貼壁細(xì)胞[5]。消化傳代過程中將胰酶充分利用起來，同時記錄細(xì)胞計數(shù)。（3）FG、BMSCs復(fù)合物制備。在紫外線下放置FG，照射1 h消毒，分別加入各白兔培養(yǎng)的傳代3次內(nèi)的BMSCs懸液，混合，標(biāo)記[7]。離心細(xì)胞，將上清液去除，使其在膠原-bBMP-DMEM和膠原-DMEM混合液中懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL[8]。

1.3.2 動物模型建立及方法? （1）新西蘭大白兔建模方法。新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機(jī)取新西蘭大白兔24只，設(shè)為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經(jīng)前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術(shù)，建立新西蘭大白兔動物模型，具體建模方法如下：對新西蘭大白兔準(zhǔn)確稱重，給予其靜脈注射氯胺酮麻醉，無菌操作下將長度為10 cm的手術(shù)切口縱行開在左側(cè)腰大肌前緣，向腹膜進(jìn)入后鈍性分離，將橫突充分暴露出來，然后將腹膜、腰大肌推開，方向為沿著橫突前方，之后將椎旁肌推開，方向為沿著橫突后方，并達(dá)到橫突根部，將橫突咬斷，充分暴露L5-6、L4-5、L3-4椎間盤與椎體;用銳刀從側(cè)方切開椎間盤纖維環(huán)，將椎間盤前后纖維環(huán)保留下來。用刮匙將部分軟骨終板、椎間盤刮出，打磨后將軟骨終板去除，打磨過程中將梭形小磨鉆充分利用起來，將骨性中板充分暴露出來，刮匙輔助下對椎間盤殘留髓核、軟骨情況進(jìn)行觀察。用椎間盤撐開器將椎間隙撐開，從而建立新西蘭大白兔椎間關(guān)節(jié)融合動物模型。（2）動物干預(yù)方法。1組建模成功后不采取任何措施處理，常規(guī)飲食、飲水;2組給予纖維蛋白膠、骨形態(tài)發(fā)生蛋白干預(yù)，每盤注射0.08～0.10 mL凝膠，止血完全后縫合切口;3組在2組基礎(chǔ)上聯(lián)合富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)，每盤注射0.08～0.10 mL凝膠，3組、2組新西蘭大白兔注射1次即可，止血完全后縫合切口[10]。術(shù)后為大白兔注射40萬U青霉素，2次/d。連續(xù)注射3 d，常規(guī)喂食，不限制其活動[11]。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較四組大白兔第12周時階段活動程度。（2）比較四組大白兔椎體后緣高度丟失情況。（3）比較四組大白兔椎間關(guān)節(jié)融合情況，融合情況通過影像學(xué)進(jìn)行評估，采用Lenke字母分級法，骨融合：A級～B級;可疑融合或無融合：C級～D級[12]。（4）比較四組大白兔X線側(cè)位片上測量Cobb角情況，通過X線片檢查對Cobb角進(jìn)行測量[13]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1四組大白兔第12周時階段活動程度比較

1組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度相比無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度最差，見表1。

2.2四組大白兔椎體后緣高度丟失情況比較

四組大白兔椎體后緣高度丟失情況比較，無明顯差異（P>0.05），見表2。

2.3四組大白兔椎間關(guān)節(jié)融合情況比較

1組椎間關(guān)節(jié)融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)融合分級最差，見表3。

2.4 四組大白兔Cobb角情況比較

四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05），見表4。

3討論

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞屬于一種骨髓細(xì)胞，具有較多的功能，如自我增殖、多向分化功能等，可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化與生長。由于該細(xì)胞收集比較簡單，且培養(yǎng)方法簡單便捷，已經(jīng)在臨床上廣泛用于骨折與骨缺損重建與修復(fù)，同時在脊柱融合中也應(yīng)用較為廣泛[14]。在實際的使用期間需要為骨細(xì)胞生長、增殖、分化提供良好前提條件的因子和支架。因此，臨床很有必要將合適的生長因子和支架材料尋找出來。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bBMP）是一種局部因子，能夠為骨組織生長、形成提供良好的前提條件，提取主體為牛骨，該因子的生物作用主要為：（1）募集間充質(zhì)細(xì)胞，對成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化進(jìn)行誘導(dǎo);（2）對其他因子進(jìn)行誘導(dǎo)，使其在骨形成過程中參與。但是，bBMP需要依賴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、骨系細(xì)胞才能將促骨生長作用發(fā)揮出來，且成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在BMP的協(xié)助下可以轉(zhuǎn)化為骨系細(xì)胞[15]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，將BMP注入到兔椎關(guān)節(jié)中，可以發(fā)現(xiàn)椎間關(guān)節(jié)融合。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，將富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植（BMSCs）、纖維蛋白膠、骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合用于兔椎關(guān)節(jié)融合中，可以有效促進(jìn)椎關(guān)節(jié)融合[16]。本研究顯示，1組椎間關(guān)節(jié)融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)融合分級最差，說明在兔椎間關(guān)節(jié)融合中，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植效果顯著，該融合與周圍肌肉韌帶血供比較豐富有很大的關(guān)系。

脊柱融合是臨床上治療脊柱相關(guān)疾病的主要方法。自體髂骨移植是臨床進(jìn)行脊柱融合的首選方法，但是很多患者會發(fā)生不良的癥狀。自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在人體各個部位中的骨髓中均存在，在整個骨髓有核細(xì)胞占0.001%～0.01%，一般臨床上使用以下方法收集骨髓間質(zhì)干細(xì)胞：（1）免疫磁珠分選法;（2）流式細(xì)胞儀分離法;（3）密度梯度離心法;（4）貼壁分離篩選法[17]。免疫磁珠分選法與流式細(xì)胞儀分離法對細(xì)胞的活性會產(chǎn)生很大的影響，甚至?xí)辜?xì)胞活性喪失，且操作方法比較復(fù)雜，因此限制了一定的臨床使用。貼壁法簡單便捷，但是獲取細(xì)胞的方法比較復(fù)雜，細(xì)胞的純度也較差，尤其對于細(xì)胞純度要求高的工作將其作為主要方法是不合適的[18]。密度梯度離心法是當(dāng)前臨床上分離、純化骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的主要方法，該方法效果較好。有相關(guān)研究顯示，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在體外一定環(huán)境下進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)可以分化、擴(kuò)增成骨細(xì)胞[19]。最近幾年臨床上通過富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)融合中，獲得了較好的效果。而在此過程中應(yīng)用密度梯度離心法有效提高了細(xì)胞的純化程度[20]。

FG主要形成于凝血反應(yīng)發(fā)生的最后階段，結(jié)合纖維蛋白原凝血酶能夠促進(jìn)纖維蛋白單體的形成，最終聚合三維立體結(jié)構(gòu)FG。FG具有較好的細(xì)胞可塑性、相容性，在生物工程載體中較為常用。在對MSCs和FG進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)的實驗過程中，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠生長于材料表面，同時會逐漸黏附，細(xì)胞在不斷延長的培養(yǎng)時間下會逐漸長到孔隙中。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G可以作為成骨細(xì)胞的支架，體外培養(yǎng)后向兔脊柱骨缺損部位植入。術(shù)后X線檢查、組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，有新骨形成于骨缺損部位，同時無炎癥反應(yīng)、排斥反應(yīng)發(fā)生。而新生的骨組織說明FG不會對MSCs的分化與增殖造成影響。

本研究顯示，1組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度相比，無明顯差異（P>0.05），4組關(guān)節(jié)活動范圍與活動度最差，這就說明，在兔椎間關(guān)節(jié)融合中，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植效果顯著，可以更好地促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)活動范圍與活動度恢復(fù)，兔椎間關(guān)節(jié)融合效果顯著。

本研究顯示，四組大白兔椎體后緣高度丟失情況相比，無明顯差異（P>0.05），四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05），說明在兔椎間關(guān)節(jié)融合中，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植對于椎體后緣高度、Cobb角的影響較小，與纖維蛋白膠、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的效果相比，無明顯差異，但是，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植在促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)活動情況與融合中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，兔椎間關(guān)節(jié)融合中，富集自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植效果顯著，可以有效促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)融合，促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)活動范圍與活動度恢復(fù)，因此，應(yīng)在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2019-10-23）