謝治梅 劉流 賀莉芳

[摘要] 目的 研究家蠅抗菌蛋白對小鼠皮膚燙傷模型創(chuàng)傷愈合的影響。 方法 將 36只健康成年小鼠隨機分為生理鹽水組、磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組，制備皮膚燙傷模型，將供試品按 0.2 mL/只的劑量涂抹創(chuàng)面上，1 次/d。于損傷后第7、14、21天測量皮膚損傷面積，計算傷口愈合率，同時用免疫組化試劑盒常規(guī)方法測BFGF、EGF含量。第21天取損傷部位皮膚，組織切片觀察其形態(tài)學變化。 結果 第21天抗菌蛋白組和磺胺嘧啶銀組小鼠皮膚損傷部位愈合率均值分別為93.15% 和91.79%，與生理鹽水組均值71.32%比較，提高了21.83%和20.47%（P<0.05）; 組織形態(tài)學顯示，21 d時抗菌蛋白組皮膚組織已完全愈合，對照組尚未完全愈合?？咕鞍捉MBFGF及EGF表達在14、21 d明顯超過對照組，差異有顯著性（P<0.05）。 結論 家蠅抗菌蛋白能改善小鼠燙傷部位肉芽組織生長狀態(tài)，可能是通過促進BFGF、EGF的表達，從而促進創(chuàng)面的修復過程。

[關鍵詞] 抗菌蛋白;燙傷創(chuàng)面;表皮生長因子（EGF）;堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）13-0027-04

[Abstract] Objective To study the effect of antibacterial protein from Musca domestica larvae on wound healing in mouse skin scald model. Methods 36 healthy adult mice were randomly divided into normal saline control group，topical sulfadiazine silver group，and Musca domestica larvae antibacterial protein group. The skin scald model was prepared. The test product was applied to the wound surface at a dose of 0.2 mL/mouse，once a day. The skin injury area was measured on day 7，14，and 21 after injury，and the wound healing rate was calculated. At the same time， the contents of BFGF and EGF were measured by conventional methods of Y immunohistochemistry kit. On the 21st day，the skin of the injured site was taken，and the morphological changes were observed in tissue sections. Results On the 21st day， the average healing rates of skin burn in mice in the antibacterial protein group and the silver sulfadiazine group were 93.15% and 91.79%，respectively，which were 21.83% and 20.47% higher than the mean of 71.32% in the normal saline control group（P<0.05）. Histomorphology showed that the skin tissue of the antibacterial protein group had completely healed on the 21st day， while the control group had not completely healed. The expressions of BFGF and EGF in the antibacterial protein from Musca domestica group were significantly higher than those in the control group on day 14 and 21，and the differences were significant（P<0.05）. Conclusion Antibacterial protein from Musca domestica larvae can improve the growth state of granulation tissue in burns of mice，which may promote the repair process of wounds by promoting the expression of BFGF and EGF.

[Key words] Antibacterial protein; Scald wound; Epidermal growth factor（EGF）; Basic fibroblast growth factor（BFGF）

近年來，研究認為抗菌蛋白通過影響細胞膜的結構和功能，起到抑菌、殺菌作用[1]。抗菌蛋白能夠抗細菌、真菌、寄生蟲，一些研究還發(fā)現(xiàn)，其還能殺傷病毒甚至多種腫瘤細胞[2-4]。家蠅體內外抗菌活性物質的研究也受到人們廣泛關注，其中研究較多的是抗菌蛋白[5]。家蠅抗菌蛋白因其分子量小，且受溫度影響小、水溶性好、無免疫原性等特點，具有廣譜的生物活性。但目前家蠅幼蟲抗菌蛋白的研究主要集中在對抗菌蛋白誘導和分離純化，以及體外試驗分析抑菌特性等方面，其作為藥物的體內實驗研究并不多[6]。研究者發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后，抗菌蛋白可能作為一種影響創(chuàng)傷愈合的細胞信號分子，參與創(chuàng)傷后上皮重建[7，8]，但其機制尚不明確。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）加速細胞分裂，促進增殖，增加細胞遷移，而堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，BFGF）作為一種生長因子，可調控靶細胞的生長、增殖與分化，進而實現(xiàn)創(chuàng)傷的快速修復，二者可促進皮膚屏障修復[9，10]。為探索抗菌蛋白在模型小鼠燒傷創(chuàng)面愈合中所起的作用及其可能機制，尤其是對表皮生長因子（EGF）及堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）表達的影響，本實驗以家蠅3日齡幼蟲為原料，金黃色葡萄球菌誘導家蠅幼蟲產生抗菌活性物質，研究家蠅抗菌蛋白對小鼠燙傷創(chuàng)面愈合率、EGF和BFGF表達的影響，探討家蠅抗菌蛋白促進創(chuàng)面愈合的可能機制，旨在研究其對組織修復的促進作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 蟲源? 家蠅幼蟲由貴州醫(yī)科大學寄生蟲學教研室吳建偉教授惠贈，參考文獻[11，12]飼養(yǎng);抗菌物質的提?。簠⒄瘴墨I[13]提取抗菌蛋白;圖像處理：IMS圖像分析系統(tǒng)Q550CW（基爾頓生物科技有限公司，上海）進行圖像信號采集與系統(tǒng)分析處理。

1.1.2 動物? 本研究所使用的小鼠（動物許可證號：GB14925-95），SPF級，6～8周大，36只雌雄各半，體重18～22 g，購于廈門大學東南附屬醫(yī)院中心實驗室，符合中國實驗動物標準。所有操作均按照廈門大學東南附屬醫(yī)院中心實驗室要求及規(guī)范執(zhí)行。

1.1.3 試劑? 10%水合氯醛，硫化鈉，抗菌蛋白（25 mg/L），磺胺嘧啶銀（10 mg/L），生理鹽水（30 mg/L）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與設計? 36只小鼠，雌雄各半，隨機分成生理鹽水組、磺胺嘧啶銀組、抗菌蛋白組，每組12只。

1.2.2 深Ⅱ度燙傷模型的建立? 腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠[14]，俯臥固定于搪瓷盤內，用10%硫化鈉除去背部毛。燒開清水，使用溫度計測得實時溫度為95℃，將電烙鐵置于水中保持沸騰30 min后，迅速取出電烙鐵無壓力置于小鼠背部，反復2～3次。燙傷后創(chuàng)面蒼白、腫脹，病理證實為深Ⅱ度燙傷。

1.2.3 創(chuàng)面處理? 燙傷模型建立后，分別用生理鹽水、 磺胺嘧啶銀、家蠅抗菌蛋白涂抹于相應組小鼠的創(chuàng)口處，自然暴露創(chuàng)口，每天定時用藥 1 次，每次0.2 mL。

1.3觀察指標

1.3.1 創(chuàng)面愈合率測定? 術后在3、7、14、21 d用直尺測量創(chuàng)面橫長（r1）和縱長（r2），根據橢圓面積公式計算創(chuàng)面面積，愈合率=（原創(chuàng)面積-測量時面積）/原創(chuàng)面積×100%[15，16]。

1.3.2 創(chuàng)面組織觀察? 創(chuàng)傷后第21天取創(chuàng)面組織，用10%甲醛固定后行蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織。

1.3.3 BFGF含量、EGF含量的檢測? 術后7、14、21 d每組分別處死小鼠3只，按免疫組化試劑盒常規(guī)方法測BFGF含量、EGF含量。圖像分析BFGF、EGF以細胞黃染為陽性。從每張免疫組化染色切片中隨機選取5個視野，輸入Q550CW圖像信號采集與分析系統(tǒng)測量陽性細胞的平均灰度值，以反映傷口局部BFGF、EGF的表達量，平均灰度值越大，BFGF、EGF表達量越小，二者關系呈反比[17]。采集分析樣本創(chuàng)面部位，通過顯微鏡拍照采集圖像與分析，計算陽性面積。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用方差分析對多個樣本均數(shù)進行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 用藥后三組小鼠創(chuàng)面愈合率的比較

第3天時，三組間無顯著性差異，7、14、21 d時抗菌蛋白組、磺胺嘧啶銀組與生理鹽水組比較創(chuàng)面愈合率有顯著性差異（P<0.05），21 d時抗菌蛋白組的愈合率達到93.15%，生理鹽水組僅為71.32%。14、21 d時抗菌蛋白組與磺胺嘧啶銀組愈合率比較無顯著性差異。見表1。

2.2 三組小鼠皮膚組織的病理學觀察

生理鹽水組：可見組織充血水腫，出血，組織疏松，表皮缺失，大量壞死，可見較多炎性細胞、肉芽組織，表明皮膚尚未愈合;磺胺嘧啶銀組：組織內仍有少量炎性細胞、纖維細胞、老化肉芽，表明皮膚組織基本愈合;抗菌蛋白組：組織內肉芽不多，大部分形成膠原，未見炎性細胞，血管分布少，表明皮膚組織已完全愈合。見封三圖6。

2.3 用藥后三組小鼠創(chuàng)面BFGF、EGF灰度值比較

EGF、BFGF以細胞黃染為陽性，陽性細胞的平均灰度值越小，其表達量越高。與生理鹽水組相比，磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組BFGF在7 d時表達增高不明顯，在14 d、21 d時表達明顯增高，差異有顯著性（P<0.05）?？咕鞍捉M與磺胺嘧啶銀組在7 d、14 d、21 d時，BFGF表達無明顯差異（P>0.05）。磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組BFGF的總體灰度值低于生理鹽水組，即BFGF的總體表達高于生理鹽水組，差異有顯著性（P<0.05）;磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組的EGF在7 d時表達增高不顯著，14 d時表達明顯增高，與生理鹽水組相比有明顯差異（P<0.05），21 d時EGF又回歸到生理鹽水組水平?；前粪奏ゃy組和抗菌蛋白組EGF的總體灰度值低于生理鹽水組，即EGF總體表達高于生理鹽水組，差異有顯著性（P<0.05）。見表2。

3 討論

燙傷組織愈合過程非常復雜，是由修復細胞、炎細胞、細胞因子、細胞外基質相互作用完成的[18]。研究表明巨噬細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞合成內源性 EGF和BFGF等，參與損傷部位的增殖和創(chuàng)面修復[19，20]。EGF可以加速上皮的再生，促進膠原蛋白合成，且有刺激血管生成等作用[21]。BFGF通過對細胞增殖與分化的促進作用，實現(xiàn)了對于各種創(chuàng)傷的快速修復[22]。一些研究發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白通過提高EGF來促進上皮細胞增殖[23，24]。家蠅抗菌肽不僅具有抗多種病原及殺傷腫瘤的優(yōu)勢，其抑菌效果甚至優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素，且不產生耐藥性[1]。家蠅抗菌蛋白與抗生素相比，其抗菌譜廣且不易損傷人體正常細胞，作用機制也與抗生素大不相同。由于燙傷導致皮膚屏障功能被破壞，極易導致創(chuàng)面感染，而創(chuàng)面感染又是影響其愈合的主要原因之一。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌是燙傷感染中主要的致病菌，其在自然環(huán)境中分布廣泛，且對抗生素易產生耐藥性[25]。因此在目前開發(fā)新型抗生素非常困難的情況下，探尋家蠅抗菌蛋白在組織創(chuàng)傷修復中的作用及其抗菌效果，開發(fā)其成為新型肽類抗生素的巨大潛能[26]。

本次實驗構建小鼠深Ⅱ度燙傷模型，建立了生理鹽水組、磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組，對各組創(chuàng)面愈合率及組織形態(tài)學，以及EGF、BFGF的表達進行研究，探尋家蠅抗菌蛋白對組織修復的影響和機制。已知磺胺嘧啶銀是一種抗菌藥，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌皆有抑菌活性，同時具有收斂作用，使創(chuàng)面干燥易結痂，可促使創(chuàng)面提前愈合。結果顯示，3 d時磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組創(chuàng)面修復能力與生理鹽水組均無明顯差異，7、14、21 d時磺胺嘧啶銀組和抗菌蛋白組的創(chuàng)面愈合能力比生理鹽水組顯著增強，第7天時，抗菌蛋白組與磺胺嘧啶銀組有顯著差異，且在7 d、14 d、21 d時，抗菌蛋白組小鼠皮膚愈合率均值均高于磺胺嘧啶銀組，結果證明，磺胺嘧啶銀和家蠅抗菌蛋白具有促進創(chuàng)面修復的能力，縮短了模型小鼠燙傷后創(chuàng)面愈合時間，且從結果中還發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌蛋白促進小鼠皮膚燙傷愈合效果與磺胺嘧啶銀效果相當甚至更佳。21 d時進行皮膚組織的病理學觀察，發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白組皮膚組織已完全愈合，較生理鹽水組愈合更好，較磺胺嘧啶銀組愈合也稍好。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，抗菌蛋白組和磺胺嘧啶銀組堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）的表達在傷后14 d、21 d時明顯高于生理鹽水組，表皮生長因子（EGF）的表達在14 d時明顯高于生理鹽水組，抗菌蛋白組的BFGF、EGF表達稍高于磺胺嘧啶銀組，提示抗菌蛋白對BFGF的合成和分泌有促進作用。同時，結果還顯示抗菌蛋白組創(chuàng)面愈合率的提高在時間上與EGF、BFGF表達增高趨勢基本一致。根據實驗數(shù)據，可以推測此結果很可能與抗菌蛋白分子促進EGF、BFGF分泌有關。

綜上所述，家蠅抗菌蛋白促進了模型小鼠燙傷創(chuàng)面的愈合，并對控制創(chuàng)面感染有一定作用?？咕鞍卓赡芡ㄟ^促進EGF、BFGF的分泌加快了組織修復，顯著加速了創(chuàng)面愈合，縮短了愈合時間。家蠅抗菌蛋白因其抗菌譜廣、抗菌效果好，且無耐藥性等優(yōu)點，可能具有開發(fā)成為新型肽類抗生素的潛能。

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（收稿日期：2020-03-03）