李 峰
Zn-MT對運動大鼠心肌抗氧化酶及細胞凋亡蛋白表達量的影響
李 峰
西安建筑科技大學(xué)體育學(xué)院,陜西 西安,710055。
目的:探討鋅-金屬硫蛋白(Zn-MT)對力竭運動大鼠(♂)心肌細胞抗氧化酶、細胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達量的影響。方法:選取雄性SD大鼠24只,隨機分為運動對照組(A)、補充Zn-MT +運動組(B),兩組大鼠均進行跑臺運動。于力竭運動后即刻取材,抗氧化酶采用比色法,心肌凋亡細胞檢測采用TUNEL法,Bcl-2、Bax蛋白表達檢測采用免疫組化法。結(jié)果:C組和B組相比,C組GSH-Px、CAT、GSH、SOD活性有不同程度的升高;可以明顯降低心肌細胞凋亡率和Bax蛋白表達率,Bcl-2表達明顯增高。結(jié)論:補充Zn-MT可以MT可以提高心肌抗氧化酶活性,通過影響心肌細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達,減少力竭運動后的心肌細胞凋亡。
鋅-金屬硫蛋白;抗氧化酶;力竭;心肌凋亡;Bcl-2蛋白;Bax蛋白
研究運動與抗氧化酶、細胞凋亡的關(guān)系的研究是探討運動疲勞機制的重要內(nèi)容之一[1],研究心肌缺血、過度訓(xùn)練可以通過降低抗氧化酶活性來提高心肌細胞的凋亡率[2,3],Bcl-2、Bax作為細胞凋亡的調(diào)控基因蛋白,其表達量在細胞凋亡中起著重要作用[4]。Zn-MT在生物體內(nèi)廣泛存在,是一種低分子量、能被金屬誘導(dǎo)且富含半胱氨酸的非酶類金屬結(jié)合蛋白[5],如何將Zn-MT與運動醫(yī)學(xué)的研究結(jié)合起來是目前研究的一個重點[6]。本實驗通過運動大鼠跑臺訓(xùn)練,研究Zn-MT對力竭運動大鼠心臟抗氧化酶活性以及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響并探討其可能機制,為運動補劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。
Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只,體重250-280g,購于陜西中醫(yī)研究所實驗動物飼養(yǎng)中心,國家標(biāo)準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng),自由飲食,動物室溫度25℃±5℃,相對濕度40%-70%,照明隨同自然變化。
實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后,隨機分為運動對照組(A)、補充Zn-MT+運動組(B),每組12只。大鼠自由飲食、攝水;B、C組以15m/min,15min/d運動量對動物進行為期3d的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練后,進行正式的一次性力竭跑臺訓(xùn)練。具體訓(xùn)練方案按照表1進行。力竭判定標(biāo)準[7]:大鼠在既定強度的訓(xùn)練時跟不上預(yù)定速度,運動遲緩、臀部壓跑道后壁,兩后肢失去主動性運動后拖達30s,利用毛刷刺激驅(qū)趕時無明顯反應(yīng);大鼠外在行為表現(xiàn)為呼吸急促、胸腹部起伏幅度大,外觀精神倦怠,俯臥位垂頭。大鼠訓(xùn)練方案見表1。
表1 訓(xùn)練小鼠運動項目
組織勻漿液制備:在最后一次運動力竭后斷頭處死,立即取出心臟,用濾紙吸干,稱取適量組織加入0.9%的生理鹽水,按W(g):V(ml)=1:9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(介質(zhì)配比:pH7.4的0.01mol/L Tris-HCL,0.0001 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%的NaCl溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進行)。然后根據(jù)劑盒說明分別于低溫冷凍離心機1000 rpm/ min離心5min或3000-4000 rpm / min離心l 0min,分離上清液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前制?0%的勻漿液,離心(3500rpm,15min,0~4℃),取上清液在1~4℃的冰箱保存待測。
切片制備:將摘取的心臟在冰冷的生理鹽水中漂洗干凈,濾紙吸干水分并稱重。中性甲醛后固定,全自動組織脫水機進行脫水,全自動組織包埋機包埋。置入4℃的4%多聚甲醛中固定,24 h后常規(guī)石蠟包埋明、切片(厚5μm)、脫蠟水化后待測。
心肌組織的處理首先采用石蠟包埋,然后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸末端標(biāo)記法(TUNEL)對細胞核中DNA3’-OH末端凋亡標(biāo)記,最后經(jīng)脫蠟、洗脫、孵育、和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)顯色,在光學(xué)顯微鏡下觀察[8]。通過對每張切片拍攝5個陽性視野,再通過每個視野中的300個心肌細胞中計數(shù)陽性細胞數(shù),用平均數(shù)計算陽性細胞所占的百分比,從而觀察結(jié)果凋亡陽性細胞分布情況。TUNEL購自Roce公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。
制作心肌組織切片,使用3 %的雙氧水對內(nèi)源性酶進行消除,然后再用微波抗原修復(fù)15min,隨后用1:5的小牛血清封閉抗原10min。在濕盒加入一抗后4℃下孵育過夜,然后再加入由生物素標(biāo)記的二抗。通過復(fù)溫,PBS沖洗后滴加二抗,再經(jīng)DAB顯色(黃),蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片,用多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行光密度測定。Bcl-2和Bax單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。
表2 鋅錳對訓(xùn)練小鼠心肌抗氧化酶活性的影響
注:*P<0.05
由表2可以看出,C組和B組相比,抗氧化酶活性均有不同程度的回升,其中GSH-Px和GSH有顯著性差異(P<0.05)。
表3 鋅-MT對訓(xùn)練小鼠心肌細胞凋亡、Bax、Bcl-2表達的影響
注:*P<0.05,**P<0.01
由表3可以看出,B組和A組相比,細胞凋亡率下降但無顯著性差異,Bax表達下降且有極顯著性差異(P<0.01),Bcl-2表達上升有顯著性差異(P<0.05),Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降(P<0.05)。
本實驗結(jié)果表明,給運動大鼠補充Zn-MT后,心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD酶活性升高,這是因為(1)鋅感應(yīng)蛋白金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1(MTF-1)和亮氨酸拉鏈蛋白上游刺激因子(USF)參與了氧化應(yīng)激對金屬硫蛋白的誘導(dǎo)[9]。而Zn-MT的啟動子中包含金屬反應(yīng)元件(MRE),MRE需要MTF-1的激活,而MTF-1又需要鋅的參與。因此,抗氧化酶中的巰基可以結(jié)合Zn-MT中的游離新Zn離子,從而使氧化酶中的的巰基減弱氧化還原反應(yīng),保護心肌細胞膜的相對完整性[10];(2)Zn-MT不穩(wěn)定的動力學(xué)特性,在機體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)中會釋放出游離的鋅金屬離子,而鋅離子的高親和性可以競爭性地阻斷其他金屬的催化性氧化反應(yīng),從而降低H2O2生成·OH的速率,另外,Zn還可以通過抑制鐵-氧-烯醇酸復(fù)合物的形成來防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的啟動;(3)由于Zn-MT在體內(nèi)會釋放出Zn離子,與抗氧化酶中的巰基結(jié)合,防止因自由基的破壞而使Zn-MT中的金屬與巰基配位鍵斷裂,因此Zn-MT分子中巰基數(shù)目的多少會在很大程度上影響其對自由基的抵抗能力。因此可以推測Zn-MT提高心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD的酶活主要是Zn-MT在機體反應(yīng)過程中釋放的Zn離子;(4)金屬硫蛋白中的Zn離子也可以通過抑制Fe離子參與氧化還原反應(yīng),從而減少抗氧化酶的消耗,最終使抗氧化酶的總量增加和抗氧化能力的提高。
細胞凋亡(Apoptosis)指為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。在機體各器官的組織細胞中,Bcl-2、Bax作為細胞凋亡調(diào)控的典型基因,其表達量與細胞凋亡密切相關(guān)。研究表明,Bcl-2在生物體內(nèi)過量表達時,會形成同源二聚體,同時通過改變線粒體對Ca2+攝取速率和總量,以及通過對線粒體通透性的調(diào)節(jié)而抑制細胞膜上脂質(zhì)過氧化物的形成,從而影響細胞凋亡的過程[11]。而當(dāng)Bax過量表達時,會以Bax同源二聚體的形式抑制Bcl-2的活性表達,從而使細胞凋亡的概率增加[12]。由于Bcl-2/Bax的比值與Bcl-2-Bax細胞凋亡率呈負相關(guān),因此若Bcl-2/Bax的比值升高會降低細胞的凋亡率;反之則會促進細胞凋亡的發(fā)生。
心肌細胞屬于受植物性神經(jīng)支配的不隨意肌,具有興奮收縮的能力但不具備增值能力。心肌細胞凋亡與心臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的保持具有重要的作用,在心臟由生理性向病理性轉(zhuǎn)變的過程中起著基礎(chǔ)性作用,是心肌細胞發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)[13]。本實驗從免疫組織化學(xué)水平檢測了Bax、Bcl-2在力竭訓(xùn)練后大鼠心肌細胞的表達以及細胞凋亡率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在運動對照組心肌細胞中細胞凋亡率升高,Bax的表達主要表現(xiàn)為上調(diào),Bcl-2表達下調(diào),Bax/Bcl-2的比值升高。提示在進行大強度力竭性運動后心肌細胞可能出現(xiàn)運動疲勞性微損傷,凋亡動態(tài)失衡。這是因為在大強度運動時,心肌處于一過性缺血狀態(tài),這對心肌是一種逆境。研究發(fā)現(xiàn),細胞凋亡的產(chǎn)生機制之一是由于自由基的大量生成而產(chǎn)生的凋亡誘導(dǎo)作用[14]。而超氧陰離子作為自由基的一種表現(xiàn)形式,可以使運動后心肌細胞的凋亡增加[15,16]。由于Bax/Bcl-2的比值更能客觀反映細胞凋亡的的情況,因此在本實驗中,運動對照組Bax/Bcl-2比值增加,說明本實驗運動方案訓(xùn)練可以增加心肌細胞Bax mRNA的表達量而減少Bcl-2 mRNA的表達量。
補充Zn-MT后,Bax表達下降,Bcl-2表達上升,Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降,說明心肌細胞的凋亡得到一定的緩解,這也說明Zn-MT在抑制細胞凋亡的過程中起著重要的緩沖作用。由于Zn-MT中含有鋅離子,而鋅是機體必需微量元素,具有促進心肌成纖維細胞合成的生物學(xué)效應(yīng)。在Zn-MT與氧自由基發(fā)生拮抗反應(yīng)的同時,Zn2+可以游離出來,可以在一定程度上對組織進行修復(fù)和減輕炎癥反應(yīng),從而減緩由于力竭運動造成的心肌細胞損傷,抑制細胞凋亡。由此可以判定Zn-MT對心肌的保護作用可以使心肌免受自由基的損傷。其機制可能是通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的過程,在降低氧化發(fā)生率的同時促進抗氧化酶活力的升高,使細胞內(nèi)外的鈣穩(wěn)態(tài)保持穩(wěn)定,通過Bcl-2和Bax蛋白在心肌中的不同表達量影響心肌細胞的凋亡,從而維持心肌的正常功能。
大強度力竭性運動會導(dǎo)致心肌細胞出現(xiàn)微引起細胞凋亡速率的加劇。補充Zn-MT可以通過增加心肌細胞抗氧化酶活性和改變Bcl-2和Bax蛋白表達,減少力竭運動后的心肌細胞凋亡,從而減輕力竭運動導(dǎo)致的心肌細胞受損。
[1] 李 莎,繆 律,林緣西. 運動訓(xùn)練與細胞自噬、細胞凋亡的分子機制[J]. 南京體育學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,15(01):27~34.
[2] 譚現(xiàn)花,張 杰,楊偉堂,等. 柔道運動員一次技術(shù)實戰(zhàn)訓(xùn)練課前后不同時間血清hs-cTnI的動態(tài)變化研究[J]. 山東體育學(xué)院學(xué)報,2017,33(05):56~60.
[3] 胡榮光,趙彥宏,張瑞萍,等. 高強度間歇游泳運動對有訓(xùn)練大鼠心肌miRNA的差異表達及相關(guān)調(diào)控通路分析[J]. 體育科學(xué),2019,39(08):38~49.
[4] 林喜秀,瞿樹林,周 桔,等. 低氧訓(xùn)練對大鼠心、肝、腎、海馬組織細胞凋亡的影響及其機制研究[J]. 中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2012,31(02):146~156.
[5] 熊正英. 自由基生物學(xué)在運動醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,42(06):100~108.
[6] 李 峰. 補充鋅-金屬硫蛋白對大鼠血清微量元素動態(tài)及抗氧化酶活性的影響[J]. 武漢體育學(xué)院學(xué)報,2010,44(12):58~61+96.
[7] 肖明珠,郭慶芳.動物運動性疲勞方法學(xué)研究之一-不同刺激方法對大鼠跑臺運動疲勞及恢復(fù)糖代謝的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,1998,17(04):334~338.
[8] 師綠江,尹昭云,任宏偉,等. 金屬硫蛋白對大鼠重復(fù)高G應(yīng)激后心肌細胞凋亡及心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響[J]. 中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2006,17(02):113~116.
[9] 段寶林. 鋅與運動能力關(guān)系研究之進展[J]. 山西師大體育學(xué)院學(xué)報,2001(03):75~77.
[10] 肖 濱,黃小波. 鈣離子調(diào)節(jié)改變與心肌缺血/再灌注損傷[J].心臟雜志,2019,31(01):98~102.
[11] 宋 敏,董萬濤. 活血定眩丸對CSA大鼠血液流變學(xué)及小腦Bcl-2、Bax表達的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志,2012,20(08):6~9.
[12] 郭 欣,劉明潔.細胞自噬干預(yù)心肌肥厚的研究進展[J].心血管病防治知識(學(xué)術(shù)版),2018(18):93~96.
[13] 廖日滔,郭靜科,李冰潔,等. 自由基相關(guān)細胞信號傳導(dǎo)的研究進展[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報,2014,36(11):1573~1583.
[14] 公 雪,李曉燕. 力竭運動對心肌組織結(jié)構(gòu)及功能影響的研究進展[J]. 心血管病學(xué)進展,2016,37(04):435~440.
常蕓. 運動性心律失常研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2015,34(01):59~68.
[15] 陳 輝,黃政德. Bcl-2、Bax與心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,16(09):116~120.
Effects of Zn-MT on the Expression of Antioxidant Enzymes and Apoptotic Proteins in Myocardium of Exercise Rats
LI Feng
Physical Education Department, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi' an Shaanxi, 710055, China.
Purpose: Probe into the influence of myocardium cell anti-oxidase, apoptosis、Bax、Bcl-2 about Zn-MT to exhaust mouse. Method:Choose 24 male SD big mice, assign to the sport control group(A), supplementing Zn-MT+sport group(B)at random. B,C groups draw materials after strength exhaust sports,adopt the colorimetry to detect anti-oxidase,adopt TUNEL law to detect myocardium apoptosis、Bcl-2, adopt immune group law detect Bax albumen express. Result:In B Group, GSH-Px, CAT, GSH, SOD active decline, there is rising after supplementing Zn-MT, compared with group B, C group myocardium apoptosis and Bax protein express decrease obviously, Bcl-2 expresses increases. Conclusion: supplementing Zn-MT Can improve the myocardium anti-oxidase activity, reduce the myocardium cells after strength exhausts sports and apoptosis through influencing the myocardium.
Zinc-metallothionein; Anti-oxidase; Exhausted; Apoptosis; Bcl-2 albumen; Bax albumen
1007―6891(2020)03―0033―03
G804.7
A
2019-07-31
2019-09-03
2017年陜西省社會科學(xué)基金項目(2017R007),陜西省教育廳專項科研計劃項目(17JK04180)。