黃小程，黃雙平，董夢婷，陳 淼，闞 寵，盧東軍，唐玉蓮，倪安妮，李根亮

(右江民族醫(yī)學院,廣西 百色 533000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，是全世界癌癥相關死亡率的第三大常見原因。多種RNA結合蛋白表達異?；蚬δ墚惓Ｅc腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-2]。RNA結合蛋白是一類能夠決定細胞分化、活動力和生長等過程的調節(jié)因子，可參與RNA的剪接、多聚腺苷化、序列的編輯、RNA 轉運、維持 RNA 的穩(wěn)定及參與其降解、細胞內定位和翻譯調節(jié)等[3]，可通過多種方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。外泌體內含有多種功能分子，廣泛參與各種生理和病理過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6]。RNA結合蛋白也可能存在于外泌體中，但其是否參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程還有待深入研究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展必然伴隨著機體對病變細胞的免疫清除，尤其先天免疫過程[7-8]。但外泌體相關RNA結合蛋白是否參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的先天免疫及如何參與也尚不清楚。

因此，本研究通過建立肝癌小鼠模型，分離癌變后的瘤體組織及健康肝組織,通過RNA-seq和生物信息學手段分析HCC瘤體組織中外泌體相關RNA結合蛋白相關基因的表達情況，分析其是否參與以及如何參與HCC發(fā)生發(fā)展過程中的先天免疫過程。研究結果可能為深入理解HCC的發(fā)生發(fā)展機制及診斷治療HCC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1肝癌小鼠模型的構建及樣本獲取:選取120只鼠齡7周左右，體重22～25 g的清潔健康昆明小鼠。將其隨機分為兩組，實驗組和對照組各60只。購自南京凱基生物技術有限公司的H22肝癌細胞系，體外培養(yǎng)至細胞指數生長期時，取細胞3 000 r/min離心、洗滌、稀釋至終濃度105個/ml，給予實驗組小鼠雙前肢腋下接種細胞懸液0.2 ml/只，對照組采用生理鹽水同法注射，正常飼養(yǎng)4周后，選出成瘤小鼠(n=50)，解剖取出瘤體作為腫瘤微環(huán)境(TM)樣本，對照組健康小鼠肝臟作生理微環(huán)境(PM)樣本(n=60)。本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2RNA提取及RNA-seq:實驗組和對照組組織樣本，采用RNA提取試劑盒提取各樣本總RNA，同組內等量取各樣本總RNA混合成混合總RNA樣本送公司測序。RNA質量檢測、逆轉錄、文庫構建、RNA-seq及去掉低質量的序列后得到待分析數據(clean reads)按常規(guī)程序完成。

1.3篩選出在兩類樣本中差異表達的RNA結合蛋白基因:以各基因匹配的clean reads數為依據，統(tǒng)計分析各基因RPKF值的差異，以實驗組和對照組同一基因之間的RPKF值比值≥2或≤0.5，且FDR值≤0.05的基因為條件，獲得兩樣本的差異表達基因。

使用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以“(cancer or carcinoma) and ‘RNA binding protein’”為關鍵詞檢索RNA結合蛋白基因，構建基因比對數據庫。通過DAVID在線數據庫(https://david.ncifcrf.gov)轉換成Ensembl gene ID后與兩樣本測序數據中的差異表達基因進行比對，篩選出兩類樣本中差異表達的RNA結合蛋白基因。

1.4參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因的獲取及功能分析:利用DAVID數據庫對以上差異表達的RNA結合蛋白基因進行在線功能富集與聚類，篩選其中參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因，再次使用DAVID篩選到的基因進行GO和KEGG分析，其中以FDR(false discovery rate)≤0.05且P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因的SNV和INDEL分析:根據RNA-seq數據對外泌體相關RNA結合蛋白基因進行單核苷酸位點變異(single nucleotide variants, SNV)及核苷酸插入/刪除(INDEL)分析，探討其與基因表達的可能相關性。

1.6參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因編碼蛋白的互作分析:采用STING數據庫(https://string-db.org/)對參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因的編碼蛋白進行互作分析。

1.7差異表達基因的RT-qPCR驗證:隨機選擇3個參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因進行 RT-qPCR 分析，內參基因為 RN18s，驗證其表達量以及RNA-seq測序結果準確性。

2 結果

通過篩選共獲得了69個參與先天免疫反應的差異表達的外泌體相關RNA結合蛋白基因。DAVID數據庫功能富集分析結果顯示，它們共參與了12個BP、4個CC、1個KEGG和3個UP-SEQ(見圖1)。GO分析發(fā)現，這些差異表達基因主要聚集在免疫應答，尤其是先天免疫，還有參與補體激活經典途徑、炎性反應等。其中大量基因存在N-連接糖基化位點、二硫鍵及信號肽。這些差異表達基因的編碼蛋白互作情況見圖2。

SNV和INDEL分析顯示，有55個差異表達基因發(fā)生了520 個SNV 和22個INDEL 位點的改變，具有統(tǒng)計學意義的有15個基因，它們分別是Apobec3、Myo1g、App、Src、Pstpip1、Aim2、Cd5l、Il1rap、C4bp、Apcs、Hc、Tec、Fgg、Ifit1和Cfi，且SNV 改變與其基因的表達呈負相關。

注：BP，生物學程序；CC，細胞組分；MF，分子功能；UP-SEQ，蛋白位點序列特征圖1 TM中瘤體組織外泌體相關差異表達基因的生物學功能

圖2 HCC中參與免疫應答的RNA結合蛋白基因編碼蛋白的互作

隨機選擇的3個差異表達基因RT-qPCR 分析，其結果與 RNA-seq 結果一致(見圖3)。3個差異表達基因和18sRNA內參基因的引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

基因引物5'-引物3'-引物18sRNAGGTGAAGGTCGGTGTGAACGCTCGCTCCTGGAAGATGGTGFasGCCAACCTGAAAACTAGGCTGCGTTTGGCTTCTTTACCCACCCtnna1AAGTCTGGAGATTAGGACTCTGGACGGCCTCTCTTTTTATTAGACGTnfrsf1bACACCCTACAAACCGGAACCAGCCTTCCTGTCATAGTATTCCT

注：圖中數值為以2為底的對數值圖3 RT-qPCR 與 RNA-seq 分析HCC中參與先天免疫反應的外泌體相關RNA結合蛋白基因的表達情況

3 討論

基因表達的轉錄后修飾是重要的表觀調控機制，轉錄后修飾包括RNA剪接、編輯、穩(wěn)定性、定位、修飾、翻譯及3′多聚腺苷酸化和5′加帽等[9]。RNA結合蛋白是轉錄后修飾的重要參與者，有多種RNA結合蛋白參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[10-11]。

本研究也顯示，與健康肝組織相比，HCC 中共有69個差異表達的外泌體相關RNA結合蛋白基因可能參與先天免疫反應，說明這些基因在參與HCC的發(fā)生發(fā)展中對早期清除癌細胞及其引起的相關炎性可能起著重要作用。在這些差異表達的基因里不同的基因在HCC發(fā)生發(fā)展的過程中可能參與不同的反應，進而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不一樣的影響。如Han等發(fā)現，RNA結合蛋白SORBS2基因通過穩(wěn)定RORA基因來抑制HCC的發(fā)生和轉移[10]。Dong等則發(fā)現，RNA結合蛋白RBM3基因通過調節(jié)環(huán)狀核糖核酸SCD-circRNA 2的產生促進HCC的細胞增殖[11]。

另外本研究還發(fā)現外泌體相關RNA結合蛋白可能還參與炎性反應。已有研究報道HCC的入侵常會引起機體的炎性反應，而持續(xù)存在的炎性可能促進癌癥的發(fā)生、發(fā)展。Yiakouvaki等研究表明，RNA結合蛋白Hur基因結合并調節(jié)先天免疫應答的有效激活，并與依賴于編碼炎性效應蛋白的mRNAs的產生和轉錄后調節(jié)相關，進而導致結腸炎相關癌癥的嚴重易感性增高[12]。本研究發(fā)現外泌體相關RNA結合蛋白基因還涉及后天性免疫反應，所以它們對HCC中癌細胞及相關炎性的清除可能是持續(xù)性的，即在后續(xù)的特異性免疫反應中也可能發(fā)揮著一定的作用。但由于后天性免疫涉及的基因較少，而先天性免疫反應涉及的基因相對較多，因此外泌體相關RNA結合蛋白基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用可能更傾向于非特異性的防御保護。

通過對這些基因的功能富集分析，發(fā)現多種外泌體相關RNA結合蛋白存在N-連接(N乙酰葡萄糖胺)糖基化位點、二硫鍵及信號肽序列，說明這些差異表達基因編碼蛋白可能是通過糖蛋白的N-粘連方式或二硫鍵方式與受體結合而參與先天性免疫反應。信號肽的存在說明多種基因編碼蛋白為膜蛋白，這與多種外泌體相關RNA結合蛋白的胞外分布特點是相一致的，這也說明外泌體相關RNA結合蛋白的功能可能涉及從胞外到胞內的信號轉導。二硫鍵是多肽鏈內部或多肽鏈之間的一種共價結合方式，表明相關分子之間連接的緊密性，這與其他研究發(fā)現相一致，即二硫鍵與癌癥病變及其遷移密切相關[13-14]。N-粘連糖蛋白是血液、尿液和唾液等體液中最常見的一種細胞分泌蛋白，其寡糖鏈分支增多及復雜化與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關[15-17]。馬瑾等發(fā)現，HP、hCE1蛋白表達變化和N-糖鏈變異可能參與了HCC發(fā)生發(fā)展過程[18]。所以推測外泌體相關RNA結合蛋白可能通過糖蛋白N-粘連的方式與腫瘤壞死因子受體的結合參與HCC中的先天性免疫反應，從而影響HCC的發(fā)生發(fā)展。對外泌體相關RNA結合蛋白基因的SNV和INDEL分析還顯示，HCC中SNV改變與其基因的表達呈正相關，這說明SNV可能對基因表達具有正調控作用。

綜上所述，本研究利用RNA-seq及生物信息學手段，發(fā)現在TM和PM中外泌體相關RNA結合蛋白基因存在差異表達，生物信息學顯示其可能涉及到多個生物學過程，且可能通過參與先天免疫影響HCC發(fā)展。推測外泌體相關RNA結合蛋白基因可能通過糖蛋白N-粘連或二硫鍵的方式與受體結合參與HCC中的先天性免疫反應，以非特異性的防御保護影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但未能對可能的機制機理進行論證和深入探討，是本研究的不足之處。今后將繼續(xù)對外泌體相關RNA結合蛋白基因可能通過先天免疫參與HCC發(fā)生發(fā)展的機制進行深入實驗研究，以期為更好理解HCC發(fā)生發(fā)展機制及診斷預防提供理論依據。