葛云龍 趙修華 祖元剛 袁安龍

(1.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.哈爾濱職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院，哈爾濱 150040； 3.廈門涌泉集團有限公司，廈門 361023)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科(Ranuncu aceae)芍藥屬(Paeonia)植物，也有學者認為應(yīng)當從毛茛科中分出單獨成立芍藥科(Paeoniaceae)，芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect Moutan)[1]，又被稱為鹿韭、白術(shù)、木芍藥，學名為牡丹，為多年生落葉灌木[2]，目前我國牡丹種植范圍廣闊，主要種植范圍分布在安徽銅陵、河南洛陽、四川、陜西漢中、山東菏澤、河北柏山、浙江、甘肅等地；其中河南洛陽、安徽、山東菏澤種植最多，據(jù)統(tǒng)計，2015年山東菏澤地區(qū)預(yù)計牡丹種植面積已達到6.67萬平方米[3]。牡丹自古以來就開始栽培，歷史悠久，也是我國固有的名花，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)牡丹的根、莖、葉、花、花粉、籽均具有很高的食藥價值和經(jīng)濟價值，可見牡丹全身是寶[4]。人們常將其分為觀賞牡丹和油用牡丹，油用牡丹也可用作中藥材使用，也是丹皮酚的主要來源，其中觀賞牡丹主要分布在河南洛陽和山東菏澤，主要是用于園林景區(qū)、觀賞花卉等；而油用牡丹以安徽銅陵的鳳丹最為著名，主要是以鳳丹牡丹品系為主。其牡丹籽主要用于壓榨牡丹籽油，具有較高的觀賞價值、藥用價值和食療保健價值。

牡丹籽油因其營養(yǎng)豐富而獨特，又有醫(yī)療保健作用，被有關(guān)專家稱為是“植物油中的珍品”，也被人稱為“液體黃金”，是中國獨有的健康保健食用油脂[5]。牡丹籽油含豐富的不飽和脂肪酸，高達90%以上，不飽和脂肪酸主要為α-亞麻酸(含量超過40%，是橄欖油的140倍)、亞油酸、油酸；飽和脂肪酸主要為棕櫚酸和硬脂酸[6]；α-亞麻酸是構(gòu)成細胞膜和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì)，是人體健康必需脂肪酸，但是人體內(nèi)不能自己合成，需要利用外界食物補充，因此是一種普遍缺乏必需營養(yǎng)素[7～8]。它可以人體多種酶的催化作用下，到達身體各處，最后通過肝臟代謝功能，轉(zhuǎn)化為人體必需的生命活性因子DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)[9]。DHA是大腦、視網(wǎng)膜等神經(jīng)系統(tǒng)膜磷脂的重要組成部分，因此對兒童的大腦發(fā)育、智力開發(fā)和視力發(fā)育起至關(guān)作用；EPA是合成體內(nèi)白三烯和前列腺素的前體。人體一旦外界食物攝取不足時，缺乏這種營養(yǎng)元素，會導(dǎo)致智力遲緩、視力減弱、免疫力下降、疲勞健忘、動脈粥樣硬化等并發(fā)癥狀的發(fā)生[10]。因此α-亞麻酸具有很高的保健、醫(yī)用價值。

我國在2011年3月22日，由衛(wèi)生部《衛(wèi)生部關(guān)于批準元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品公告》(2011年第9號)批準牡丹籽油為新資源食品[11]；2014年國家食品藥品監(jiān)督管理總局，將牡丹籽油原料列為可用化妝品目錄，標志著牡丹籽油可以正式進入食用油、化妝品原料市場[12]。牡丹籽油的提取方法主要有物理壓榨法、有機溶劑浸出法、超臨界CO2萃取法、亞臨界萃取法等，其中有機溶劑浸出法會存在有機溶劑的殘留情況，超臨界CO2萃取法設(shè)備成本高、生成能力低，亞臨界萃取法會有丁烷殘留等缺點，而物理壓榨法是利用外界壓力直接將牡丹籽中油脂分離出來，壓榨過程中無化學溶劑殘留，具有安全、衛(wèi)生、無污染、營養(yǎng)成分不破壞等優(yōu)點。本研究主要利用物理壓榨法制備牡丹籽油，并利用氣相色譜檢測牡丹籽油中α-亞麻酸含量和牡丹籽油對清除DPPH自由基、ABTS自由基、Fe2+的還原以及清除-OH自由基的能力等進行體外抗氧化性能的研究。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

CBS-95型螺旋壓榨榨油機(長春長白山牌榨油機)；7890A型氣相色譜儀(美國Agilent公司)；紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；DENVER型電子分析天平(美國丹佛儀器公司)；水浴鍋(上海遼卓科貿(mào)有限公司)；渦旋振蕩器(常州市金壇晨陽電子儀器廠)。

1.2 材料

牡丹籽(山東菏澤)；市售牡丹籽調(diào)和油(產(chǎn)地陜西)；正己烷(天津市富于精細化工有限公司，分析純)；濃硫酸(北京化工廠有限公司，分析純)；無水乙醇(天津市天力化學試劑有限公司，分析純)；甲醇(山東禹王實業(yè)有限公司)；乙酸乙酯(天津市富于精細化工有限公司，分析純)；鐵氰化鉀(天津中津化工有限公司，分析純)；三氯乙酸(天津市富于精細化工有限公司，分析純)；三氯化鐵(天津市致遠化學試劑有限公司，分析純)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(英文縮寫DPPH，德國Sigma)；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(英文縮寫ABTS，Solarbio)；水楊酸(上海源葉生物科技有限公司)。

2 牡丹籽油的制備

將牡丹籽原料進行篩分、脫殼處理。檢測脫殼的牡丹籽含水率，確定微波干燥輸送帶的運行速度。進行微波干燥，牡丹籽仁表面溫度在75℃左右為正常溫度，干燥后水分在7%～8%為宜。將干燥后的牡丹籽仁進入螺旋榨油機中進行第一遍壓榨牡丹籽油，螺旋擠壓的籽粕經(jīng)粉碎直接進入旋榨油機中進行二次壓榨，收集兩次壓榨的牡丹籽油，最后得到的牡丹籽油和殘渣混合液體，再進行離心(5 000 r·min-1，20 min)，上清液即為牡丹籽油。

3 牡丹籽檢測方法

3.1 α-亞麻酸含量檢測

氣相色譜參數(shù)設(shè)置如下：氣相色譜柱型號：DB-WAX毛細管柱，長30 m，孔徑230 mm，初始柱溫保持在150℃下保持1 min，之后以10℃·min-1的速度升溫到230℃，保持此溫度20 min；進樣針和檢測器的溫度分別為200℃和280℃，氫氣和空氣的流速分別為40和400 mL·min-1，氮氣作為載氣其流速為25 mL·min-1，分流比為20∶1。

氣相色譜樣品制備：精確吸取100 μL制備好的牡丹籽油，加入10 mL正己烷，充分混勻，再加入2% H2SO4—甲醇溶液，攪拌均勻，80℃下反應(yīng)30 min(或者常溫反應(yīng)2 h)進行甲酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入10 mL去離子水，搖勻后靜止20 min，取上清液進行氣相檢測，進樣6 μL。

3.2 抗氧化性檢測

3.2.1 清除DPPH自由基

樣品制備：分別取牡丹籽油和牡丹籽調(diào)和油各5 g于2個50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯：水混合液(1∶2)定容至50 mL，為100 mg·mL-1樣品液，梯度稀釋至90、80、70、60、50、40、30、20、10 mg·mL-1待用。

試劑準備：精確稱取DPPH 0.005 8 g于燒杯中加入100 mL乙醇充分溶解，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

檢測：取上述待測液1.5 mL加入1.5 mL DPPH檢測液，混合均勻。室溫避光靜置30 min。于517 nm處測吸光值。計算公式如下：

DPPH自由基清除率=(A0-A)/A0×100

(1)

式中：A0代表1.5 mL混合液加入1.5 mL DPPH檢測液的吸光值；A代表1.5 mL樣品加入1.5 mL DPPH檢測液的吸光值。

3.2.2 清除ABTS自由基

樣品制備：分別取牡丹籽油和牡丹籽調(diào)和油各5 g于2個50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，為100 mg·mL-1樣品液，梯度稀釋至0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01 mg·mL-1待用。

試劑準備：精確稱取ABTS藥品0.1920 g加入50 mL甲醇，混合溶解；在稱取0.0946 g過硫酸鉀加入50 mL去離子水中混合溶解；然后兩者混合均勻，避光靜置12～16 h。用時取適量，用乙醇稀釋，吸光值為0.7±0.002。

檢測：取上述待測液0.5 mL加入3 mL ABTS檢測液，混合均勻。室溫避光靜置30 min，于734 nm處測吸光值。計算公式如下：

ABTS自由基清除率=(A0-A)/A0×100

(2)

式中：A0代表0.5 mL混合液加入3 mL ABTS檢測液的吸光值；A代表0.5 mL樣品加入3 mL ABTS檢測液的吸光值。

3.2.3 Fe2+還原力

樣品制備：分別取牡丹籽油和牡丹籽調(diào)和油各5 g于2個50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，為100 mg·mL-1樣品液，梯度稀釋至90、80、70、60、50、40、30、20、10 mg·mL-1待用。

試劑準備：配置0.2 mol·mL-1、pH6.6磷酸緩沖液(3.56 g Na2HPO4·2H2O加超純水定容至100 mL)，取62.5 mL；稱取7.16 g Na2HPO4·12H2O加超純水定容至100 mL，取37.5 mL；兩者混合均勻，為磷酸緩沖液；配置1%鐵氰化鉀：稱取1 g鐵氰化鉀加超純水定至100 g；10% TCA：稱取10 g TCA加超純水至100 g；0.1% FeCl3：稱取0.1 g FeCl3加超純水至100 g。

檢測：1 mL磷酸緩沖液加入1 mL 1%鐵氰化鉀再加入2 mL樣品，混勻。50℃保溫20 min，加入1 mL 10% TCA，混勻，離心10 min。取上清2 mL再加入1 mL超純水和0.4 mL 0.1% FeCl3，混勻，靜置10 min，于700 nm處測吸光值。吸光值越大，還原力越強。

3.2.4 清除羥(-OH)自由基

樣品制備：分別取牡丹籽油和牡丹籽調(diào)和油各5 g于2個50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，為100 mg·mL-1樣品液，梯度稀釋至25、20、15、10、5 mg·mL-1待用。

試劑準備：精確配置6 mmol·L-1水楊酸、6 mmol·L-1FeSO4以及8 mmol·L-1H2O2(H2O20.91 g加入乙醇100 mL)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

檢測：在37℃環(huán)境下，1 mL樣品加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸和0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4，混勻后加入1 mL 8 mmol·L-1H2O2，37℃水浴15 min，于510 nm處測吸光值。計算公式：

-OH清除率=(A3-(A1-A2)/A3)×100%

(3)

式中：A1代表1 mL樣品加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL 8 mmol H2O2；A2代表1 mL樣品加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL乙醇；A3代表1 mL混合液加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL 8mmol·L-1H2O2。

圖1 牡丹籽油氣相色譜圖Fig.1 GC of peony seed oil

圖2 牡丹籽調(diào)和油油氣相色譜圖Fig.2 GC of peony seed harmonized oil

4 牡丹籽油檢測結(jié)果

4.1 α-亞麻酸含量檢測結(jié)果

本實驗提供兩種牡丹籽油進行α-亞麻酸(ALA)含量檢測，即為牡丹籽油(實驗室壓榨)、牡丹籽調(diào)和油(市售)。經(jīng)氣相色譜檢測如圖1～2可知，實驗室壓榨牡丹籽油中α-亞麻酸含量為43.12%、而牡丹籽調(diào)和油(市售)α-亞麻酸含量為29.99%。

圖3 不同濃度樣品的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of the samples with different concentrations

圖4 不同濃度樣品的ABTS自由基清除率Fig.4 ABTS radical scavenging rate of the samples with different concentrations

4.2 抗氧化性檢測結(jié)果

4.2.1 清除DPPH自由基能力

DPPH是一種穩(wěn)定的有機自由基，對DPPH自由基的清除能力可作為抗氧化活性評價的一項重要指標。如圖3所示，隨著兩種牡丹籽油的濃度從10 mg·mL-1增加到80 mg·mL-1，兩種牡丹籽油清除DPPH自由基能力逐漸增大；可以看出牡丹籽油清除率最強，在80 mg·mL-1時，牡丹籽油清除率達到了47.48%，牡丹籽調(diào)和油清除率達到36.80%，是牡丹籽調(diào)和油的1.29倍。所以牡丹籽油具有更高的抗氧化力。

4.2.2 清除ABTS自由基能力

清除ABTS自由基能力是另一種考察抗氧化性的方法。如圖4所示，隨著兩種牡丹籽油的濃度從10 mg·mL-1增加到80 mg·mL-1，兩種牡丹籽油清除ABTS自由基能力逐漸增大；可以看出牡丹籽油的清除率最強，在80 mg·mL-1時，牡丹籽油清除率達到69.79%，牡丹籽調(diào)和油清除率達到46.15%，是牡丹籽調(diào)和油的1.51倍。證明了牡丹籽油具有更強的清除ABTS自由基能力，再次驗證DPPH的結(jié)果。

圖5 不同濃度樣品的Fe2+還原力Fig.5 Fe2+ reducing power of the samples with different concentrations

圖6 不同濃度樣品的-OH自由基清除率Fig.6 -OH radical scavenging rate the samples with different concentrations

4.2.3 Fe2+還原力分析

牡丹籽油和牡丹籽調(diào)和油的Fe2+還原力曲線如圖5所示，通過對鐵氰化鉀的還原能力分析，樣品濃度從0.01 mg·mL-1增加到0.1 mg·mL-1，兩種牡丹籽油的對Fe2+還原能力均逐漸增強。當濃度達到0.1 mg·mL-1時，兩種牡丹籽油的還原力都達到了最高，牡丹籽油的吸光度為1.05，牡丹籽調(diào)和油吸光度為0.29。以普魯士藍的總生成量為指標，對比兩種牡丹籽油樣品在700 nm處的吸光度，牡丹籽油的還原力明顯高于調(diào)和油，在0.1 mg·mL-1時的還原值是調(diào)和油的3.62倍。還原力測定結(jié)果與清除DPPH、ABTS自由基能力測定的結(jié)果一致。

4.2.4 清除-OH自由基能力

羥基自由基清除率是反應(yīng)油脂抗氧化作用的重要指標。-OH是人體內(nèi)最活潑，是多數(shù)氧自由基的母體，可衍生出多種自由基，也是毒性最大的自由基，它直接損傷各種生物大分子、生物膜以及細胞膜及細胞DNA[13]，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和機體衰老[14]。通過Fenton反應(yīng)體系測定富集牡丹籽油、自制牡丹籽油和市售牡丹籽油的羥自由基(-OH)清除率，本試驗通過測定了不同質(zhì)量濃度的兩種牡丹籽油進行清除-OH能力測定，其結(jié)果見圖6所示，隨著兩種牡丹籽油的濃度從5 mg·mL-1增加到25 mg·mL-1，兩種牡丹籽油清除-OH自由基能力逐漸增大；可以看出牡丹籽油的清除率最強，在25 mg·mL-1時，牡丹籽油的清除率64.35%，牡丹籽調(diào)和油清除率達到44.57%，是調(diào)和油的1.44倍。證明了牡丹籽油具有更強的清除-OH自由基能力，再次驗證DPPH、ABTS的結(jié)果。

5 討論

通過對兩種牡丹籽油α-亞麻酸含量檢測結(jié)果可知，牡丹籽油中α-亞麻酸含量為43.12%、而牡丹籽調(diào)和油α-亞麻酸含量只有29.99%。通過對兩種牡丹籽油的清除DPPH、ABTS、Fe2+還原力以及清除羥自由基的能力的實驗對比，兩種牡丹籽油都具有一定的抗氧化功能，強弱順序為：牡丹籽油>牡丹籽調(diào)和油。清除DPPH自由基能力牡丹籽油是調(diào)和油的1.29倍；清除ABTS自由基能力牡丹籽油是調(diào)和油的1.51倍；對Fe2+還原能力牡丹籽油是調(diào)和油的3.62倍；清除-OH自由基能力牡丹籽油是調(diào)和油的1.44倍。因牡丹籽油中本身具有很高的α-亞麻酸含量，具有一定的抗氧化功能，而牡丹籽調(diào)和油經(jīng)檢測得知α-亞麻酸的含量只有29.99%，因此抗氧化性能減弱。因此，通過本實驗得知牡丹籽油的體外抗氧化能力較強，這對牡丹籽油的研發(fā)具有重要參考意義。