楊 斌 孟慶瑤 張 凱 段義忠

(榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，榆林 719000)

葉綠體普遍存在于綠色植物和一些自養(yǎng)生物中，是植物細(xì)胞中的質(zhì)體之一，主要進行光合作用，承擔(dān)著合成蛋白質(zhì)、色素、脂肪酸及淀粉等功能[1]。在被子植物中，葉綠體基因組一直處于相對保守的狀態(tài)，導(dǎo)致其進化速度緩慢，被用于植物分類和分子進化研究的途徑[2]。其結(jié)構(gòu)大多為雙鏈環(huán)形，具有4個區(qū)域，即1個大單拷貝區(qū)(Large single copy，LSC)、1個小單拷貝區(qū)(Small single copy，SSC)以及2個反向重復(fù)序列區(qū)(Inverted repeats，IRA/IRB)。由于生存環(huán)境和遺傳差異的影響，不同種植物葉綠體基因組會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異的現(xiàn)象[3～5]，常見的結(jié)構(gòu)變異有缺失、重復(fù)、倒位和易位。

作為最常用的生物學(xué)分析方法之一，DNA測序為遺傳信息的揭示和基因組分析等研究提供重要數(shù)據(jù)，對確定植物進化關(guān)系等方面發(fā)揮重要作用?！跋乱淮睖y序技術(shù)(Next-generation sequencing)是繼第一代測序技術(shù)(Sanger)之后而得名的，主要包括3種測序技術(shù)：Roche/454焦磷酸測序(2005年)、Illumina/Solexa聚合酶合成測序(2006年)和ABI/SOLiD連接酶測序(2007年)技術(shù)，這3種測序技術(shù)與Sanger相比共同具有單次運行(Run)產(chǎn)出序列數(shù)據(jù)量大的特征，又被統(tǒng)稱為高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，促使更多綠色植物的完整葉綠體全基因組相繼公布在NCBI數(shù)據(jù)庫，在2010年NCBI數(shù)據(jù)庫中僅有146種，截止2019年4月已有3 000多種植物的葉綠體全基因組被記錄[6]。

矮扁桃(Amygdalusnana)屬薔薇科(Rosaceae Juss.)植物，起源于歐洲東南部和亞洲中西部[7]。作為古地中海第三紀(jì)子遺物種，主要分布在哈薩克斯坦、俄羅斯和中國，不僅可作為油料和藥物的原材料，還可以作為育種研究的原始材料。目前，國內(nèi)外對于扁桃亞屬(Subgen.Amygdalus)植物的研究主要集中在物質(zhì)鑒定、生長發(fā)育、植物引種、開發(fā)利用和進化分析等方面[8～12]。在眾多關(guān)于扁桃亞屬研究中，基于葉綠體全基因組的相關(guān)研究比較缺乏。鑒于此，本研究對矮扁桃葉綠體全基因組進行測序、組裝、注釋和特征剖析，并與其他28種近緣物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在豐富矮扁桃的葉綠體基因組遺傳信息，為今后桃屬植物的系統(tǒng)進化關(guān)系研究和物種鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

矮扁桃新鮮葉片采集于新疆裕民縣(46°05′51.02″N，82°48′9.06″E)，處理后保存于-80℃環(huán)境中備用。

1.2 基因組的提取和測序分析

1.2.1 葉綠體DNA的提取

常見的高等植物葉綠體DNA提取的方法主要有3種：蔗糖密度梯度離心法、Percoll密度梯度離心法和高鹽—低pH法，并已在高粱、甘蔗、蘋果[13～15]等物種的葉綠體DNA提取中成功應(yīng)用，未曾發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于矮扁桃的報道。由于葉綠體基因組的穩(wěn)定性，在細(xì)胞質(zhì)遺傳、基因功能和遺傳多樣性等方面的研究廣泛應(yīng)用，而獲取無污染、結(jié)構(gòu)完整的葉綠體DNA則是開展相關(guān)研究的前提條件之一。因此本研究決定采用改良的蔗糖密度梯度離心法，便于提取完整的矮扁桃葉綠體DNA[16]。

1.2.2 葉綠體DNA測序分析

將提取的總?cè)~綠體DNA通過Nano Drop 2000微量分光光度檢測濃度是否符合標(biāo)準(zhǔn)，并用1%瓊脂糖電泳檢測質(zhì)量。利用Invitrogen試劑盒對產(chǎn)物進行純化，使所提取的葉綠體DNA達到高通量測序要求。最后將樣品送至北京百邁客生物科技有限公司檢測合格后，進行Illumina HiSeq Xten測序，得到的原始序列(Original series)數(shù)據(jù)以FASTQ格式存儲。FASTQ文件中存在一定比例的低質(zhì)量序列，濾除質(zhì)量較低的序列末端、Adapter序列和含N比例達到10%的序列等[17]，最終得到高質(zhì)量的待分析序列(Clean Reads)。

1.3 基因組裝與注釋方法

對低質(zhì)量過濾后的數(shù)據(jù)用SOAPdenovo 2.04拼接軟件(http://soap.genomics.org.cn/soap denovo.html)組裝成重疊群，再根據(jù)reads的paired-end和overlap優(yōu)化組裝結(jié)果。對于序列中的一些缺口(Gaps)，通過Gapcloser對組裝結(jié)果進行補洞和修正。最后利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)驗證IR區(qū)和SC區(qū)的連接，進而獲得完整的矮扁桃葉綠體全基因組。利用DOGMA在線注釋軟件(http://phylocluster.biosci.Ttexas.edu/dogma/)結(jié)合NCBI上已報道的薔薇科近緣物種的注釋結(jié)果對矮扁桃葉綠體全基因組進行基因注釋，并通過GeneiousR8進行手動修正注釋。最后利用OGDraw(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)[18]對矮扁桃葉綠體全基因組進行基因組圖譜繪制。將新獲得的矮扁桃葉綠體全基因組上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MK764428。

1.4 重復(fù)序列與SSR分析

利用在線軟件REPuter(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)[19]，鑒定矮扁桃葉綠體全基因組中重復(fù)序列，包括正向重復(fù)(Forward repeats)、反向重復(fù)(Reverse repeats)、回文重復(fù)(Palindromic repeats)和互補重復(fù)(Complement repeats)，最小重復(fù)長度設(shè)為20bp，兩個重復(fù)之間的一致率大于90%。利用MISA軟件(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php)鑒別矮扁桃葉綠體全基因組中簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)，最小重復(fù)次數(shù)設(shè)為：單核苷酸≥10，二核苷酸≥6，三核苷酸≥5，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸都為≥3。

1.5 IR區(qū)邊界的收縮和擴張分析

葉綠體全基因組的長度多態(tài)性主要由于IR區(qū)的擴張和收縮造成的，本研究比較矮扁桃、扁桃及其親緣物種的IR邊界區(qū)收縮與擴張情況，并利用IRscope(https://irscope.shinyapps.io/irapp/)繪制對比圖[20]。

1.6 矮扁桃系統(tǒng)發(fā)育分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫選取薔薇科和虎耳草科(Saxifragaceae)共計28種植物的葉綠體全基因組與矮扁桃葉綠體全基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MAFFT軟件[21]對29個序列進行多重序列比對，將比對結(jié)果檢驗和校正后導(dǎo)入MEGAX軟件，以厚葉溲疏(Deutziacrassifolia)和黃脈繡球(Hydrangealuteovenosa)作為外類群，通過近鄰結(jié)合法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉置信值基于重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮扁桃葉綠體全基因組的結(jié)構(gòu)特征

矮扁桃的葉綠體全基因組長度為158 596 bp；呈現(xiàn)出經(jīng)典的四段式環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中大單拷貝區(qū)(LSC)長度為86 771 bp，小單拷貝區(qū)(SSC)長度為19 037 bp，兩個反向重復(fù)序列(IRA/IRB)長度都為26 394 bp。矮扁桃的葉綠體全基因組中CG含量為36.8%，在LSC區(qū)域中CG含量分別為34.5%，SSC區(qū)域中CG含量分別為30.3%，IR區(qū)域中CG含量分別為42.7%和42.6%(見表1)。矮扁桃的葉綠體全基因組共注釋130個基因，其中蛋白編碼基因(Protein-coding genes，PCGs)為85個，轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)為37個，核糖體RNA(rRNA)為8個(見表2)。在130個注釋基因中，有92個為單拷貝基因，包括69個PCGs、23個tRNA基因；剩余19種基因均重復(fù)1次，包括PCGs中的ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycf15、ycf2、ycf1和tRNA基因中的trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC以及4種rRNA基因。其中LSC區(qū)域完全包含59個PCGs和22個tRNA基因，SSC區(qū)域包含12個PCGs和1個tRNA基因，而IR區(qū)域則包含7種PCGs(rpl2、rpl23、ndhB、rps7、ycf1、ycf15、ycf2)和7種tRNA基因(trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC)以及全部4種rRNA基因(見圖1)。

表1 矮扁桃葉綠體全基因組堿基組成

2.2 葉綠體全基因組重復(fù)序列與SSR分析

微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)又稱簡單重復(fù)序列(SSR)，基本重復(fù)單位只有1～6 bp，存在于真核生物的細(xì)胞核、線粒體和葉綠體基因組中，在個體之間具有良好的通用性，被廣泛地應(yīng)用于物種鑒定及群體和個體之間的遺傳差異分析。通過所設(shè)置參數(shù)，在矮扁桃葉綠體全基因組中共鑒定出71個SSR位點，其中單核苷酸重復(fù)數(shù)目為56，二核苷酸重復(fù)數(shù)目為3，無三核苷酸重復(fù)，四核苷酸重復(fù)數(shù)目為6，五核苷酸重復(fù)數(shù)目為2，沒有六核苷酸重復(fù)，但有4個復(fù)合SSR位點(見表3)。在矮扁桃葉綠體全基因組的簡單重復(fù)序列中有91.07%為AT類型，而CG類型僅有5個，且有66.20%的SSR位點位于IGS區(qū)，18.30%在內(nèi)含子區(qū)，15.49%位于CDs中。

在矮扁桃的葉綠體全基因組中，檢測出48條長度大于20 bp的重復(fù)序列，其中正向重復(fù)有16個，反向重復(fù)有8個，回文重復(fù)有23個(見表4)。僅有1個互補重復(fù)，位于trnT-UGU-trnL-UAA基因間隔區(qū)(IGS)。其中最長的重復(fù)序列為No.1，是回文重復(fù)序列，長53 bp，位于trnG-GCC-trnR-UCU基因間隔區(qū)；最短是正向重復(fù)序列No.47，僅長23 bp，位于ycf1基因上。

表2 矮扁桃葉綠體全基因組注釋基因信息

注：(2)表示重復(fù)單元數(shù)為2

Note: (2)indicates that the number of the repeat unit is 2

2.3 IR區(qū)邊界的收縮和擴張分析

矮扁桃葉綠體全基因組由4個經(jīng)典區(qū)域組成，包括2個反向重復(fù)序列區(qū)(IRA/IRB)、1個大單拷貝區(qū)(LSC)和1個小單拷貝區(qū)(SSC)。在綠色植物長期發(fā)育與進化的過程中，IR區(qū)會出現(xiàn)與兩邊界的單拷貝區(qū)(LSC/SSC)重疊的現(xiàn)象，不同植物所表現(xiàn)的重疊長度的不同。我們選取矮扁桃的5種近緣種(扁桃Amygdaluscommunis；蒙古扁桃Amygdalusmongolica；桃Amygdaluspersica；大葉桂櫻Laurocerasuszippeliana；沙梨Pyruspyrifolia)的葉綠體全基因組作為參考序列，比較分析矮扁桃的IR區(qū)邊界的擴張和收縮情況(見圖2)。分析結(jié)果顯示6種薔薇科近緣植物之間的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)差異較小，表現(xiàn)出葉綠體基因組高度的保守性。6種被子植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相似，且都具有6個基因位于IR區(qū)邊界處，分別是LSC/IRB的rpl22、rps19和rpl2，IRB/SSC的ndhF，SSC/IRA的ycf1，IRA/LSC的trnH。但仍存在一定的差異性，這6種植物的葉綠體基因組中rps19基因全部橫跨LSC/IRB區(qū)，但在IRB區(qū)向rps19基因不同程

表3 矮扁桃葉綠體全基因組SSR預(yù)測

注: p.單個SSR類型；p1/p2/p3/p4/p5/p6中數(shù)字分別表示構(gòu)成基序的堿基個數(shù)；c.復(fù)合SSR類型；*為位于內(nèi)含子區(qū)

Note: p.Indicates single SSR type; The numbers in p1/p2/p3/p4/p5/p6 indicate the number of bases constituting the motif, respectively; c. Indicates composite SSR type;*is located in the intron region

表4 矮扁桃葉綠體全基因組的重復(fù)序列

注：F.正向重復(fù)；R.反向重復(fù)；C.互補重復(fù)；P.回文重復(fù)；*.重復(fù)序列位于內(nèi)含子區(qū)

Note: F.Direct repeat; R.Inverted repeat; C.Complementary repeat; P.Palindrome repeat;*is the repeat sequence located in the intron region.

圖1 矮扁桃葉綠體全基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map of A.nana

圖2 6種植物的葉綠體IR區(qū)邊界分析Fig.2 Boundary analysis of chloroplast IR region of 6 plants

圖3 基于29種植物構(gòu)建的近鄰結(jié)合樹Fig.3 Nearest neighbor tree of 29 plants

度擴張了68～183 bp；在矮扁桃和蒙古扁桃葉綠體基因組中ndhF基因完全位于SSC區(qū)，而在其他的葉綠體基因組中IRB區(qū)發(fā)生了不同程度的擴張。在這6種植物的葉綠體基因組中trnH基因與IRA/LSC邊界區(qū)的距離都有所不同，其中矮扁桃的距離最遠(yuǎn)。

2.4 葉綠體全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

選取矮扁桃在內(nèi)的29種植物進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以厚葉溲疏和黃脈繡球作為外類群，利用近鄰結(jié)合法構(gòu)建的發(fā)育樹包含25個節(jié)點，低于100%的僅2個節(jié)點，其余節(jié)點均為100%，表明聚類結(jié)果可信度較高(見圖3)。從系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn)矮扁桃、蒙古扁桃和山桃(Amygdalusdavidiana)以100%的支持率聚在同一分支上，而榆葉梅(Amygdalustriloba)和長柄扁桃(Amygdaluspedunculata)所構(gòu)成的單系支持率也為100%。在扁桃亞屬中，矮扁桃在親緣關(guān)系上與蒙古扁桃更近，而與長柄扁桃和榆葉梅的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

3 討論

被子植物的葉綠體基因組具有典型結(jié)構(gòu)，一般為閉合環(huán)狀的雙鏈DNA并包括4個高度保守的區(qū)域，其大小通常為115～165 kB，編碼為110～130個基因[22]。4個結(jié)構(gòu)區(qū)域長度范圍通常為：IR區(qū)(16～27 kB)、LSC區(qū)(80～90 kB)和SSC區(qū)(20～28 kB)。盡管大多是植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)保守，但是在各區(qū)域大小上卻不盡相同，如在木犀科(Oleaceae)植物中測得SSC區(qū)長度在13 252～17 908 bp[23]。本研究矮扁桃的葉綠體全基因組序列長度為158 596 bp，包括IRs區(qū)(26 394/26 394 bp)、LSC區(qū)(86 771 bp)和SSC區(qū)(19 037 bp)，為進一步確定被子植物葉綠體基因組的各結(jié)構(gòu)區(qū)域長度范圍提供參考依據(jù)。同時對包括矮扁桃在內(nèi)的6種植物進行IR邊界區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)6種植物的rps19基因全部橫跨LSC/IRB區(qū)，這與5種已知的菊科(Compositae)植物的IR區(qū)分析結(jié)果相同[24]，不僅降低了本研究結(jié)果的偶然性，也體現(xiàn)出被子植物葉綠體基因組的保守性。葉綠體基因組的SSR標(biāo)記不僅保留該基因組SSR標(biāo)記的特點，而且有較高的重復(fù)性，可作為種質(zhì)鑒定的一種途徑。本研究中的矮扁桃的葉綠體全基因組中共有71個SSR位點，其數(shù)量要遠(yuǎn)大于禾本科(Gramineae)植物[25]，而小于?？?Moraceae)植物[26]；并發(fā)現(xiàn)其中未涉及三核苷酸重復(fù)類型，然而在其他被子植物的葉綠體全基因組中卻存在三核苷酸重復(fù)類型[27]。

為進一步確定矮扁桃在被子植物中的進化地位和親緣關(guān)系，選取NCBI已公布的28種植物，以厚葉溲疏和黃脈繡球作為外類群進行系統(tǒng)進化分析。本研究中榆葉梅和長柄扁桃以100%的支持率聚于同一分支，這與邱蓉和程中平等人通過傳統(tǒng)植物學(xué)性狀和核質(zhì)DNA分析長柄扁桃和榆葉梅親緣關(guān)系的研究結(jié)果一致[28]。除此之外，矮扁桃、蒙古扁桃和山桃聚在同一分支上，并且矮扁桃與同屬的蒙古扁桃關(guān)系最近，這與邱蓉基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合[29]。

利用矮扁桃在內(nèi)29種植物葉綠體全基因組序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為桃屬(Amygdalus)植物之間的進化途徑及近緣物種間的親緣關(guān)系提供有力的證據(jù)，同時對矮扁桃葉綠體基因組的分析為其在分子標(biāo)記開發(fā)和分子鑒定等研究提供參靠數(shù)據(jù)。