Salesh Kumar Jindal Major Singh Dhaliwal Om Prakash Meena

（1. Department of Vegetable Science, Punjab Agricultural University, Ludhiana 141004, India;2. Directorate of Research, Punjab Agricultural University, Ludhiana 141004, India）

1 引言

辣椒原產南美，有34個栽培種和野生種[1-4]，多數為二倍體，2x = 24。辣椒獨具辣味，辣味強度由辣椒堿含量決定，辣椒素是一種主要的辣椒堿類物質[5]。目前世界上栽培的辣椒品種，主要屬于C. annuumL.、C. chinenseJacq.、C. baccatumL.、C. frutescensL.和C. pubescensRuiz & Pavon等 5個栽培種。C. annuum種植廣泛，并馴化和選育了大量的品種，一般有辣味辣椒作為香料，甜椒作為蔬菜[6]。辣椒適應性強，在熱帶和溫帶地區(qū)廣泛種植，甜椒則在溫帶地區(qū)更受歡迎。辣椒為常異花授粉作物，雜種優(yōu)勢非常明顯。近年來，優(yōu)良雜交品種因受農民青睞而大面積推廣。利用雄性不育系生產雜交種子，可降低制種成本50%左右，提高種子純度[7]。辣椒NMS和CMS均在雜交種子生產上應用。

Martin 和Crawford（1951）首次在灌木辣椒種發(fā)現核雄性不育[8]。迄今為止，已報道20個獨立遺傳的核不育基因，即ms1（與msp等位基因）、ms2到ms9（mc9）、ms10（mc509）、ms11（mc705）、ms12到ms15、msc-1、msc-2和ms k[6,9-11]。除基因Dms（ms5突變）為顯性外[12]，其他核不育均由一個單隱性基因控制。核不育基因之間關系尚不完全清楚，Lee等[13]報道認為ms1、ms3、ms10和msk基因彼此為非等位基因。

Peterson（1958）在印度引入的“PI 164835”材料中首次發(fā)現胞質雄性不育（CMS）[14]。研究表明，CMS不育由線粒體基因組決定，母系遺傳，不育性是由細胞質不育（S）和細胞核不育（rf）相互作用決定，不育性通過基因（Rf）恢復；除了遺傳因素外，低溫也會引起育性暫時恢復[11,15]。不育系（A系）基因型為Srfrf，保持系（B系）基因型為Nrfrf，恢復系（C系）基因型為NRfRf，可利用CMS“三系”生產雜交種子。

利用NMS和CMS生產雜交種子，各有利弊。利用不育系選育辣椒新品種，關鍵是選育不育系、保持系和恢復系。利用NMS缺點：傳統(tǒng)的多代回交方法選育NMS系，繁瑣、費時[9]；生產種子時母本中只有50%不育株。優(yōu)點：不要保持系，通過不育系后代中可育株與不育株雜交生產不育系；環(huán)境因素對不育性影響較??；容易找到恢復系。因此NMS在甜椒和辣椒雜交育種中應用廣泛。利用CMS缺點：不育性受低溫環(huán)境因素[14-15]、多等位遺傳[16-17]和修飾基因[15,18]的影響，生產雜交種時容易出現微粉，影響種子純度；恢復系較少。優(yōu)點：母本100%不育，雜交種子生產過程中無需去雄，節(jié)約生產成本。

過去二十年，植物分子遺傳學和DNA技術取得了重大進展。DNA標記已成為作物改良計劃的重要組成部分[19-20]?；赑CR標記，辣椒已經構建了一批具有覆蓋整個辣椒基因組、分布廣泛的種間和種內遺傳圖譜，其中Qin等[4]和Kim等[21]分別于2014年發(fā)布了最全面的遺傳圖譜。育種家從辣椒基因組獲取信息，從不同的連鎖群（LGs）中選擇標記，為標記輔助育種（MAB）和基因克隆提供技術支撐，有利于選育優(yōu)良育種材料。

利用現有的遺傳圖譜，開發(fā)與NMS和CMS基因的相關標記。開發(fā)的標記，特別是共顯性標記，能夠區(qū)分雜合子和純合子。利用這些標記，通過對基因型進行選擇，能縮短育種時間。連鎖標記有助于快速篩選和挖掘等位基因。種質資源篩選表明，辣椒中Rf基因較多，甜椒中rf基因較多[22-23]。通過MAB方法，將辣椒的“Rf”等位基因轉入甜椒C系，將甜椒的“rf”等位基因轉入辣椒B系，可擴大CMS系應用范圍；利用恢復性狀的修飾基因相關標記，可選育高恢復率的C-系[18]。利用NMS連鎖標記，提高不育系的利用效率，確保親本純度100%，降低種子生產成本，提高種子產量[24]。近年來，品種的DNA指紋圖譜已成為品種登記的強制性要求，也是保護育種者權利的必要手段[25]。

本文收集了與辣椒雄性不育相關的最新標記信息，并推測它們在辣椒雜種優(yōu)勢利用與遺傳育種中的應用前景。

2 構建遺傳圖譜

分子標記技術促進了作物遺傳連鎖圖譜的構建、遺傳分析和分子輔助選擇。等位基因挖掘、基因定位和克隆，需要標記重復性好的遺傳圖譜[26]。

Tanksley（1984）[27]在14個同工酶的基礎上，構建了第一張辣椒分子連鎖圖譜，其中9個同工酶位點排列在4個LGs中。Prince等[28]（1993）基于192個RFLP標記，構建了一張由19個LGs組成、遺傳距離為720 cM的連鎖圖譜。Livingstone等[29]基于特定的F2群體構建的遺傳圖譜，由11個大LGs（76.2～192.3 cM）和2個小LGs（19.1～12.5 cM）組成，圖譜距離1 245.7 cM，標記間的平均距離9.0 cM。由于許多標記以番茄基因為探針，因此利用該圖譜可以對辣椒基因組與番茄基因組進行比較。

Kang等[30]用 TF68（C.annuumcv.）×Habanero（C. chinensecv.）的F2群體，構建了辣椒種間連鎖圖，含有150個RLFP和430個AFLP標記，由11個主要LGs（206～60.3 cM）和5個次要LGs（32.6～10.3 cM）組成，遺傳距離1 320 cM，標記間平均距離7.5 cM；80%的RFLP標記來源辣椒基因克隆，并在整個基因組中均勻分布。該連鎖圖譜覆蓋率與Livingstone等[29]構建的相似，為研究辣椒次生代謝產物提供依據。Rao等[31]用 “Maor”（C. annuumcv.）דBG 2816”（C.frutescens野生種）的BC2群體，構建辣椒種間連鎖圖譜，92個RFLP標記分布在12條全長1 100 cM的染色體上，與Livingstone等[29]構建的特異性圖譜相似，并對辣椒產量相關性狀進行了QTLs定位。

Lee等[32]構建了“SNU2”辣椒遺傳圖譜，由15個連鎖群組成，共有333個標記，包括46個SSR和287個RFLP標記（146個新位點和141個來自Kang等[30]開發(fā)的SNU-圖譜），覆蓋距離1 761.5 cM，標記間平均距離為5.3 cM。新增的146個RFLP標記位點涵蓋了辣椒基因組克隆位點、辣椒抗性相關克隆位點、番茄基因組克隆位點、辣椒素相關克隆位點以及辣椒其他的一些基因位點。SNU2圖譜有15.3%標記（51個標記）來源番茄，其余標記來自辣椒。

Sugita等[33]構 建 的 甜 椒 DH系（K9-11×AC2258）連鎖圖譜，含有518個標記（382個AFLP、122個RAPD、7個SCAR、3個 RFLP和4個CAPS標記），由11個大LGs（56.7～118.5 cM）和5個小LGs（1.8～33.1 cM）組成，圖譜距離1 043.1 cM，標記間的平均距離為4.6 cM。Ben-Chaim等[34]用“Maor”和“olyminary”的雜交后代構建了辣椒-番茄比較遺傳圖譜， RAPD、RFLP和AFLP等177個標記分布在12個連鎖群中，全長1 740 cM。RFLP標記的排列順序與Livingstone等[29]報道的相似，并首次鑒定了與辣椒果實性狀相關的55個QTLs。Ben-Chaim等[35]基于SSR、AFLP和RFLP標記（728個標記）構建了另一張連鎖圖譜，由12個大LGs和4個小LGs組成，總長度1 358.7 cM，鑒定了與辣椒素含量相關的QTLs。

Barchi等[36]用“Yolo Wonder”和“Criollo de Morelos 334”（CM334）親本的重組自交系群體，構建了一張高分辨率連鎖圖譜，包含507個AFLP、40個SSR、19個RFLP、17個SSAP和4個STS標記，圖譜總距離1 857 cM，其中1 553 cM定位到12個辣椒單倍體染色體上，還有304 cM未定位。在49個LGs中，14個LGs包含10～60個標記，36個LGs包含＜10個標記，標記間平均距離為5.71 cM。該圖譜比Ogundiwin等[37]報道的圖譜長（1 466 cM）。

Yi等[38]構建的連鎖圖譜，含有139個新的EST-SSR、41個已發(fā)表的SSRs（共180個SSRs）和63個RFLP標記組成，有14個LGs，距離為2 201.5 cM，標記間的平均距離為9.1 cM；EST-SSR標記分布在所有LGs上，每條LG有2～39個ESTSSRs。由于相互易位造成的假連鎖，圖譜中1號和8號染色體沒有分開，因此沒有8號染色體[29,32]。Lee等[32]將13號LG和15號LG分別定位到2號和12號染色體上，3個小LGs沒有定位。

Minamiyama等[39]利用DH群體構建的C.annuum連鎖圖，包含374個SSR、AFLP、CAPS和RAPD標記，其中106個新開發(fā)的SSR標記分布在13個LGs中，覆蓋1 042 cM的距離。除13號LG外，所有LG均含有2個以上的SSR標記，其中C位點被定位到13號LG上。PIC值較高的標記均勻定位到LGs上，該連鎖圖譜可作為辣椒的參考圖譜。

目前辣椒還沒有一張完整的基因組遺傳圖譜，12個連鎖群不能對應于單倍體染色體。由于不同圖譜中共同標記較少，圖譜之間的標記不能比較。因此，需要一張形成共識的基因圖譜作為參考遺傳圖譜，不同連鎖群有穩(wěn)定的標記，能提供綜合信息。

Lefebvre等[40]利用3個DH群體構建的種內遺傳圖譜，有14個LGs，含有85個RFLP和RAPD標記，覆蓋距離820 cM。Lefebvre等[26]報道的第一個功能詳細圖譜，由3個單獨的種內圖譜排列而成，長685～1 668 cM，有16～20個LGs，其中包括已知功能基因。這3個圖譜的整合使得12個LGs與辣椒的染色體相對應，顯示出與番茄圖譜的對應關系。共有100個已知功能基因標記和5個具有經濟價值的位點。

Paran等[41]利用6張獨立圖譜構建的辣椒綜合圖譜，由2 262個標記組成，覆蓋長度1 832 cM，主要包括AFLP（1528）、番茄和辣椒RFLP（440）、RAPD（288）和一些已知的基因序列、同工酶和形態(tài)學標記。綜合圖譜合成了15個gaps，而單個圖譜的gaps數量從21到50不等。綜合圖譜的平均標記密度為0.8 cM，最大密度為2.1 cM。綜合圖譜有助于增加標記密度和基因組覆蓋率，開發(fā)緊密連鎖標記，支撐MAS在育種中應用。Lee等[42]用4張圖譜[32,38,43-44]構建的另一張辣椒綜合圖譜，含 有 AFLP、RFLP、rRAMP、SSR、BAC-end序列STS、RFLP序列STS和WRKY等標記，有805個種間標記（密度2.2 cM，圖譜距離1 858 cM）和745個種內標記（密度2.5 cM，圖譜距離1 892 cM），新開發(fā)的單拷貝型PCR分子標記132個（57個來自BAC末端序列，13個來自RFLP和62個來自SSR）。

Mimura等[45]用C. annuum的“California Wonder”和“LS2341”（JP187992）雜交，建立DH群體，整合了許多可重復的標記，構建了第一張具有12條染色體的C. annuum的SSR遺傳圖譜，與Minamiyama等[39]、Wu等[46]和Yi等[38]構建的遺傳圖譜基本相同。該圖譜包含151個SSR、90個AFLP、10個CAPS和2個STS標記，長度為1 336 cM。因有很多基于PCR的錨定標記，其中的SSR和STS標記位置與以往報道的圖譜較為一致[32,36,39]，因此能夠與其他辣椒遺傳圖譜進行比較。開發(fā)了新的CAPS和SSR引物，并對影響果實發(fā)育、生長和抗青枯病等相關性狀進行QTLs定位。該圖譜對C. annuum的MAS和QTLS有一定的參考價值。

Wu等[46]構建了第一張完整的遺傳圖譜，包含299個辣椒、番茄同源分子標記，以及263個保守的COSII標記，所有標記都覆蓋在與12條染色體相對應的LGs，圖譜長1 613 cM，標記間平均距離6.9 cM。該圖譜基于COSII標記，因此能夠推斷辣椒和番茄基因組之間的親緣關系，為茄科植物的染色體進化提供新線索。Moulin等[47]構建的C. baccatum的F2群體綜合遺傳圖譜，由12個主要LGs和4個次要LGs組成，定位了42個SSRs、85個ISSRs 和56個RAPDs，距離為2 547.5 cM，標記間平均距離14.25 cM。為將C. annuum性狀轉育到C. baccatum， Minamiyama等[39]開發(fā)了62個SSR標記，其中有42個SSR定位在C. baccatum。該圖譜有助于研究C. baccatum與辣椒屬其他種的關系。

Sugita等[48]從6 528個克隆和13 003個cDNA/EST序列中分離出1 736個基因組SSR標記和1 344個cDNA衍生SSR標記。利用自交系雜交（K9-11×MZC-180）得到的DH系，構建了第一張以SSR標記為主的高密度種內連鎖圖譜（KLDH圖譜），12個LGs，有597個分子標記（69個cDNA衍生的SSR，196個基因組SSR，107個先前報道的 SSR，34個 SNP/InDel，164個 AFLP，27個RAPD），遺傳距離2 028 cM，標記之間的平均距離小于4 cM。與Wu等[46]構建的種間COSII圖譜比較，兩個圖譜的遺傳距離和標記分布相似，說明KL-DH圖譜覆蓋了辣椒的整個基因組。

Kim等[21]對C. annuum的兩個品種進行了重新測序，對C. chinense野生親緣種進行了de novo測序，認為辣椒品種CM334（C.annuumcv.）全基因組650.2 Gb（186.6×基因組覆蓋率），大小為番茄的4倍。Qin等[4]報道了C.annuum的Zunla-1及其野生后代Chiltepin的全基因組序列，通過與其他茄科植物基因組相比，Chiltepin的基因組擴張了約0.3 Mya，全基因組3.48 Gb，含有34 476個蛋白質編碼基因，約79%基因定位在染色體上，形成了一個高密度辣椒遺傳圖譜。辣椒基因組序列研究有望加速茄科植物分子標記的開發(fā)、遺傳圖譜的構建、候選基因的評價、經濟性狀的改良、進化和比較基因組學的研究。

目前，已開發(fā)出多種SNP和InDel標記，可快速構建新的辣椒連鎖圖譜。新一代測序技術的出現為辣椒等重要作物的高通量基因分析提供了技術支撐，如Roche/454、Solexa/Illumina和 AB SOLiD、Polonator和HeliScope等技術已被廣泛應用，為了檢測包括SNP和InDels在內的遺傳變異，并在作物遺傳學和育種中開發(fā)基于DNA的分子標記[49]。已經有一些高通量SNP基因分型平臺，包括Illumina Infinium iSelect HD array（國際 HapMap 聯合會[50]），Affymetrix Axiom陣列（國際HapMap聯合會[50]），Douglas Array Tape（www.dougl assci entif ic.com），Fluidigm dynamic arrays[51]，限制性酶測序基因型（GBS）[52]和擴增子測序[53]。Lee等[54]利用母本（C.annuum“NB1”）和父本（C.chinense“Jolokia”）雜交的F2群體，NGS重測序獲得的116個SNP（HRM）標記，構建了辣椒遺傳圖譜（12個LGs），總距離為1 167.9 cM，可直接用于雙親不同性狀的QTLS分析。

為了促進單克隆抗體MAB和辣椒基因組結構和/或組織的分析，Park等[55]利用“NuMex RNaky”（RN）（C.annuum）和 “PI159234”（CA4）（C.chinense）雜交，構建了F2群體“AC99”，利用ESTs開發(fā)SNP，將512個標記定位到12個LGs上，構建了一張高密度SNP圖譜，包括214 IBP、143個 COSIS、48個 EST-SNP（ESNP）和 107個其他（84個SSR和23個RFLP）標記，圖譜覆蓋2 335.6 cM，兩位點距離3.1（LG P8）～6.7 cM（LG P5），平均距離為4.5 cM。Li[56]利用BA3和B702（C.annuum）雜交構建了F2群體（n = 178個后代），通過對雙親的全基因組重測序，基于InDel，構建了第一張純粹的辣椒InDe遺傳圖譜（BB-InDel），由12個LGs組成，包含251個InDel標記，遺傳距離1 178.01 cM，標記間平均距離5.01 cM。為了加快分子標記的開發(fā)和應用，鑒定影響辣椒開花時間相關性狀QTLs，Tan等[57]利用“BA3” （C.annuum）和 “YNXML”（C.frutescens）種間雜交產生的F2代，基于InDel和SSR標記，構建了一張連鎖圖譜，由13個LGs組成，整合了129個InDel和95個SSR標記，遺傳距離1 249.77 cM，標記平均距離5.60 cM。錨定標記的遺傳圖譜和物理圖譜的比較分析表明，該圖譜幾乎覆蓋了整個辣椒基因組。在2號染色體上檢測到一個影響開花時間的主效QTLS，命名為Nle2.2。

Lee等[58]利用C. baccatum的“Golden-aji”和“PI594137”雜交的F2（n=93），構建了一張C. baccatum的SNP遺傳圖譜，包含12個LGs，395個HRM標記，距離為1 056.2 cM，標記間平均距離為2.67 cM。通過與“CM334” 1.5版的物理圖譜[21]比較，首次發(fā)現染色體3和染色體5、染色體3和染色體9之間相互易位，可能引起C.annuum和C.baccatum之間的生殖障礙。Mahasuk等[59]利用“Bangchang”(C.annuum) דPBC932”（C.chinense）F2群體（n = 126個體）和“PBC80”（C.baccatum）דCA1316”（C.baccatum）F2群 體（n = 146個體），創(chuàng)建了兩個SNP基因圖譜，利用高通量KASP技術，對炭疽病抗性進行QTLs定位。種間圖譜（PBC932圖譜）包含12個LGs和214個SNP，長824 cM，標記間平均距離為3.85 cM。種內“PBC80”圖譜包含12個LGs和403個基于KASP的SNP，長1 270 cM，標記間的平均距離為3.15 cM。在“PBC932”和“PBC80”圖譜上分別鑒定了2、5個與抗性炭疽病相關的QTLs。

Han等[60]利用C.annuum的“Perennia”和“Dempsey”的F7:10的120 RILs，構建了辣椒種內第一張超高密度bin圖譜，含有2 578個bin，遺傳長度1 372.2 cM，bin間平均距離為0.53 cM。對辣椒園藝性狀進行QTLs檢測，共檢測到86個控制17個園藝性狀的QTLs。Hulse-Kemp等[61]利用C. frutescens“Tabasco”和C. annuum“P4”雜交構建的F2群體（n = 90個體），構建了一個單倍型圖譜（HapMap），5 546個標記分別定位在12個 LGs的1 361 bin中，長度1 392.3 cM。建立了辣椒高通量、高密度的SNP基因分型平臺，即PepperSNP16K陣列。

Cheng等[62]利 用C.annuum“BA3” 和C.fru-tescens“YNXML”雜交的297個F2植株，構建了一個具有5 569個SNPs（3 826個遺傳bin）的高密度種間遺傳圖譜，具有Infinium iSelect SNP陣列的Illumina（稱為CapSNP15K），覆蓋長度為1 628.83 cM，bin標記平均距離0.45 cM，鑒定了與果實著生方向有關的QTLS，其中一個主效QTLS命名為Up12.1，定位在LG12。根據“Zunla-1”基因組的注釋，在該QTLS區(qū)域內共預測了65個蛋白質編碼基因，為辣椒果實著生方向變異相關基因的分離奠定了基礎。利用SLAF-seq技術，Zhu等[63]用C. chinense“740” 和C. annuum“CA1”雜交的150個F2個體，構建了一個具有種間分子高密度遺傳圖譜，全長1 586.78 cM，包含12個LGs，共有9 038個SLAF標記，平均距離為0.18 cM。他們還利用復合區(qū)間作圖（CIM）和全基因組復合區(qū)間作圖（GCIM）進行QTLS分析，確定了3個開花時期的QTLS和3個每個節(jié)點開花數QTLS。Zhang等[64]采用SLAF-seq方法，利用C.annuum品種PM702和FS871雜交的F10代的 146個RIL，獲得高密度遺傳連鎖圖譜，包含12個LGs，共有9 328個SLAF標記，遺傳距離為2 009.69 cM，標記間平均距離為0.22 cM。首次在LG02上鑒定出了與辣椒第一花節(jié)緊密相關兩個主效QTLs（Ffn2.1和Ffn2.2）。

辣椒的遺傳圖譜可以分種間[29-31,38]和種內[26,34,36,39,45,48]兩種。種間群體標記多態(tài)性高，但仍受到不均等分離、種群結構安排不合理、低授粉率這些因素的影響[46]，種內圖譜對MAS利用有限[26]。未來，可用的遺傳圖譜將由多拷貝AFLPs和RAPDs以及單拷貝RFLP、SSR、SCAR、CAPS、SNP和STS分子標記組成。由于多拷貝只能在可視化凝膠上產生少數條帶，單拷貝標記盡管繁瑣、成本高、耗時，但比多拷貝類型標記使用將更廣泛[42]。表1總結了辣椒遺傳連鎖圖譜的簡要細節(jié)。利用分布遺傳圖譜中LGs的標記，研究辣椒雄性不育基因的連鎖標記。例如，Aulakh等[66]從遺傳連鎖圖譜[32,38-39,67]中選擇SSR標記，鑒定與NMSms10基因相關的分子標記。

表1 辣椒遺傳連鎖圖譜

續(xù)表1

3 辣椒核雄性不育

3.1 NMS選育和評估

通過自然突變或EMS、伽瑪射線或X射線處理，選育了十幾個辣椒NMS[11,68]。Martin和Crawford[8]（1951）在 4526、69a和 4558等辣椒品種中發(fā)現NMS，已發(fā)現20個獨立遺傳的NMS基因[9]。shibriss和Frankel[68]在甜椒“All Big”中發(fā)現了一種天然的雄性不育植株（植株108-3），不同季節(jié)表現雄性不育或單性結實，于1969年選育出不育系并生產雜交種子。shibriss和Rylsky[69]將該雄性不育源命名為ms1，他們還從另一個甜椒品種“California Wonder”中獲得一個穩(wěn)定的雄性不育突變體，并命名為ms2。

Daskaloff[70-72]利用輻射處理誘導雄性不育突變，獲得5個雄性不育基因，即ms3、ms4、ms6、ms7和ms8。用X射線處理保加利亞品種“kapia 794”的種子，在M2家系中發(fā)現一個雄性不育隱性突變體，由ms3基因控制[70]。通過對保加利亞品種“Zlaten Medal”進行γ射線輻照，獲得了一個隱性NMS突變體，命名為ms8[72]，該不育基因決定的雄性不育性在露地和塑料大棚中栽培表現均非常穩(wěn)定[73]。

Pochard[74]在3個辣椒NMS突變體中分離出3個雄性不育基因，即ms9、ms10和ms11。Shifress[75]在甜椒品種Gambo中鑒定出一個雄性不育突變體（植株編號3633），并命名為ms12。Meshram和Narkhede[76]在辣椒品種CA 452-1中發(fā)現一個雄性不育自然突變體（ms13）。Pathak等[77]從品種“Kalyanpur selection”分離雄性不育植株，由隱性ms14基因控制。Daskalov和Poulos[12]報道了一個顯性核雄性不育基因Dms，為ms5突變。中國利用兩個甜椒雄性不育突變體msc1和msc2生產雜交種子[78-79]。

旁遮普農業(yè)大學將“Ludhiana”的核雄性不育基因“ms10”（原名為mc509[74]）轉育到法國抗多種病害品種“Punjab Lal”中，并選育了NMS系“MS12”[80]，通過利用“ms12”基因培育了3個商品化雜交品種“CH-1”[81]、“H-3”[82]和“CH-27”[83]。韓 國 選 育 了“GMS1”、“GMS3”、“GMSK” 和“GMSP”等NMS系，并用于F1雜交種子的商品化生產[13, 24]。

臺灣的世界蔬菜中心（WorldVeg）保存了一個源自雜交種“Novator F1”、具有ms3的NMS系，該系由匈牙利蔬菜作物研究所（VCRI）1987年提供[84]，并在匈牙利生產F1種子。

3.2 標記開發(fā)和NMS基因圖譜構建

已報道的20個辣椒NMS基因，只開發(fā)了幾個相關分子標記。Lee等[85]建立雜交品種“Mirage”和“Fiesta”的2個F2代群體，采用AFLP-BSA技術，利用256個引物開發(fā)了1個與顏色連鎖的未鑒定基因的CAPS標記，鑒定了5個多態(tài)性引物，并將一個AFLP標記Egat/Mcgg轉化為CAPS標記（PmsM1-CAPS），位于ms基因2～3 cM處。采用相同的技術，通過對1 024個引物進行篩選，鑒定了 1個 AFLP標 記（514 bp）（E-AGC/M-GTG），距ms1位點3 cM，通過對MF和MS植株之間的AFLP E-AGC/M-GTG標記進行測序分析，Lee等[24]開發(fā)了一個共顯性MS1-SCAR標記。在另一項研究中，Lee等[86]確定3個AFLP標記（Eagg/Mccc276、Eagc/Mctt178和 Ecag/Mtgc204） 與ms3基因緊密相連，在篩選的512個引物中，這3個與ms3等位基因共分離。對MF和MS植株之間的引物內部和側翼區(qū)域進行測序分析，將AFLP標記（Ecag/Mtgc204）轉化為GMS3-CAPS的CAPS標記。Lee等[87]鑒定了AFLP標記（E-GTA/M-ACG100），并將其轉化為CAPS標記（GMSK-CAPS），與msk基因共分離，連鎖距離為0 cM。然而，這些基因都沒有定位到辣椒基因組上[24,85-87]。

為提高辣椒MAS的準確度，需要共分離和/或基于基因的分子標記。Jeong等[10]利用HRM分子標記，對1 118個F2代分離群體進行研究，將與ms1共分離的基因定位到C.annuum5號染色體上869.9 kb的區(qū)域。HRM是一種簡單、快速、成本較低的SNP基因分型方法[88]。Kim等[21]從53個特異SNPs引物中，獲得12個與ms1基因緊密連鎖的HRM標記，利用基因預測分析，發(fā)現在869.9 kb序列中有11個開放閱讀框（ORFs），它們與一年生辣椒參考基因組CM334編碼序列（CDS）1.55相同。序列比較分析表明，基因CA05g06780，與擬南芥雄性不育系1（MS1）同源，可能是一年生辣椒的ms1的候選基因，共分離標記32187928-HRM與ms1基因緊密相連。對1 118株F2代進行分析，沒有發(fā)現這種標記的重組體。利用標記32187928-HRM對48份辣椒育種材料和15個F1商品種進行有效性檢驗，結果表明NMS表型與標記完全相關。

Naresh等[84]以辣椒分離的F2群體（ms3基因）和甜椒穩(wěn)定的F6自交系群體（msw基因）為材料，進行序列分析（GBS）和基因定位（ms3和msw）。GBS技術在利用小群體獲得與單核雄性不育（ms）基因緊密連鎖標記方面顯示出高效性。利用GBS技術對ms3和msw基因的SNP標記進行了鑒定，在辣椒和甜椒中分別鑒定出9 713和7 453個SNP，采用BSA方法，在1號染色體（物理位置70 730 824 ～ 96 273 123）、5號染色體（物理位置32 890 811）上分別鑒定出4個與ms3基因共分離的SNPs、1個與msw基因共分離的SNPs。將SNPs轉化為CAPs和dCAPS標記，對于ms3基因，開發(fā)了HPGMS2（CAPs）和HPGMS3（dCAPS）2個標記，距離3.83 cM；甜椒的dCAPS標記（SPGMS1）與msw基因完全同源。為了驗證ms3基因連鎖分子標記（HPGMS2和HPGMS3）的效果，對183株已知育性的F2代進行檢測，這兩個標記均能將Ms3ms3（雜合子MF）、Ms3Ms3（純合子顯性MF）和ms3ms3（純合子隱性mS）基因型分開。與msw基因相關的標記SPGMS1與不育性共同分離，能將雜合（Mswmsw）MF植株與純合隱性（mswmsw）MS植株區(qū)分開來。這些標記能在苗期對MS和MF單株進行鑒定，用于MAS和雜交種子生產。作者還認為，msw（32 187 928）的分子標記位于Jeong等[10]報道的ms1基因869.9 kb（31 516 016 ～ 32 385 930）區(qū)域內，msw和ms1很可能是同一基因（等位基因）；基因測試將有助于確認msw和ms1之間關系。

Bartoszewski等[89]利用不育系 320×Elf（MF）雜交，構建甜椒F2群體，利用RAPD-BSA技術，鑒定了7個與ms8位點相關的標記。RAPD引物，N16-800、P15-530、V17-320、W06-520和Z05-760在偶合期，Q07-1100、V01-1000在分離期與ms8基因連鎖。將4個RAPD標記轉化SCAR-P2、SCAR-V17、SCAR-N2和 SCAR-V01標記，SCAR-P2和RAPD-Z05-760最接近ms8位點（4.6 cM），SCAR-V17和 RAPD-W06-520分別位于6.8和7.4 cM處，SCAR-N2、RAPD Q07-1100和SCAR-V01分別在16.1、17.5和18.1 cM處，所有標記均位于ms8位點的同一側，LOD = 3。此外，他們還鑒定了2個與ms8基因相關的COSⅡ/CAPS標記。利用Lefebvre等[26]、Wu等[46]的辣椒參考圖譜進行比較，表明ms8位點位于辣椒4號染色體的下臂。但與ms8基因座緊密相連的標記仍然缺乏。Lee等[90]開發(fā)了一個HRM標記GMSE，該標記與甜椒中未知的NMS位點連鎖，定位在AC99圖譜[42]的5號染色體上，距標記TG23 、TG363距離為 8 cM、6 cM。TG363是Lee等[42]開發(fā)的AC99和SNU7圖譜中的一個RFLP通用標記。

在基因組重測序的基礎上，Cheng等[91]確定了一個強候選基因，即Capana02g002096，位于C.annuum的msc-1位點，命名為Msc-1，該基因為編碼擬南芥DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)的同源基因，有7-bp的缺失，是一個bHLH轉錄因子，參與早期的絨氈層發(fā)育，控制雄性不育?；?-bp缺失，開發(fā)了一個indel標記——indel-12。為了確認標記Indel-12和MS性狀之間的共分離，建立了兩個NILs群體，一個510株F2群體（17Q3626），一個46個辣椒自交系（均為MF）群體?；蜩b定結果表明，在所有群體中，標記Indel-12與msc1位點共分離，從遺傳學上推測，msc-1基因位點可能在C.annuum辣椒ms1基因的上游。在已發(fā)現的20個NMS基因中，僅韓國利用msk基因進行辣椒育種。利用SNP標記，Jeong等[92]繪制了msk位點附近精細圖譜，通過對807株F2群體中MF（MskMsk）和Ms（mskmsk）全基因組序列，鑒定了SNP標記，開發(fā)與定位了15個HRM標記，msk基因定位到10號染色體上的145 kb基因組區(qū)域。

Aulakh等[65]定位了C.annuum雄性不育基因ms10。采用BSA法檢測了F2群體，篩選了558對SSR引物，發(fā)現2個標記AVRDC-PP12和AVRDC_MD997，與ms10位點的連鎖距離分別為7.2 cM和20.8 cM，定位在1號染色體175 694 513 ～175 694 644、175 438 699 ～ 175 438 872。但辣椒屬中其他種NMS基因相關的標記仍然缺乏。表2列出了與NMS基因相關的可用標記。

表2 與NMS基因相關的可用標記

這些標記在雜種優(yōu)勢育種中有著廣泛的應用前景。由于不育性由隱性基因控制，用常規(guī)回交方法選育新的NMS系繁瑣、費時[24]。共顯性標記能區(qū)分MF植物是雜合子還是純合子[19]，可從基因型水平上進行選擇，無需自花授粉再回交或雜交，從而節(jié)省時間和資源。使用MAS選育新的NMS系，可節(jié)省50%時間，繁殖種群的數量可以大大減少。利用標記輔助技術，Aulakh等[93]將NMS系“MS-12”的ms10基因轉育到另外優(yōu)良辣椒自交系中。對“MS-12×VR-16”、“MS-12×S-217621”、“MS-12×Selection Dev” 和“MS-12×DCL-524” 等 4個回交后代（BC2F2）進行篩選，開發(fā)了SSR標記“AVRDC-PP12”。結果表明，在BC2F2的前3個雜交后代中，該標記與ms10基因共分離，重組頻率分別為3.22%、4.16%和3.27%，交換值小于5%，因此該標記可作為ms10基因分子輔助選擇標記，用于不育基因的轉育。

綜上所述，與辣椒ms基因緊密連鎖的分子標記有：（1）ms1相關標記2個，MS1-SCAR標記[24]和HRM標記（32187928-HRM）[10]。（2）ms3相關標記 3 個，GMS3-CAPS 標記[86]、HPGMS2（CAPS）和 HPGMS3（dCAPS）標記[84]。（3）ms8相關標記2個，SCAR-P2和RAPD Z05-760標記[89]。（4）1個msw基因連鎖的dCAPS標記（SPGMS1）[84]。（5）1個與msk基因連鎖的GMSK-CAPS標記[87]。（6）1個與msc1基因連鎖的indel-12標記[91]。（7）1個與未知基因連鎖的GMSE HRM標記[90]。這些標記與不育基因連鎖共分離，在不育基因轉育和辣椒雜種優(yōu)勢育種計劃方面具有潛在用途。

為了提高MS植物的比例，Shifriss和Pilowsky[94]雜交了兩個攜帶ms1和ms2基因的等基因系，期望雙不育基因MS×MF后代在單基因分離中產生75%的MS植株，而不是50%。通過常規(guī)育種，聚合多個基因是非常困難的。MAS能有效聚合多個不育基因，提高選育NMS系效率。利用共顯性標記[24,66,85-87,89]在苗期區(qū)分MS和MF植物，因此可以確保種子生產區(qū)的母本100%純度。

4 辣椒胞質雄性不育

4.1 不育系的選育與評價

一般甜椒具有保持基因（rf）[11,22-23,95-97]，通過將甜椒的rf基因轉育到細胞質不育（S）材料中選育新的CMS系[95]。shifress和Frankel[95]將23個小果辣椒品系與3個具有rf基因的甜椒品系雜交，尋找細胞質不育新來源。兩個群體（1005株和1006株）的分離模型表明，可育對不育為顯性，不育受單隱性基因控制。

Madhavi Reddy等[98]選 育 了 MS-1、MS-2、MS-3和MS-4等4個不育性穩(wěn)定的CMS及其保持系。Pákozdi等[99]報道不育系 202、203、204和205在5月、6-7月和8-9月3個生長季節(jié)中沒有形成有活力或功能的花粉。Yazawa等[100]成功地培育出了2個不育性穩(wěn)定辣椒CMS“P-MS”和“Murasaki-MS”。Liu等[101]在臺灣世界蔬菜中心育成了3個花粉活性差的不育系“CCA4759”、“CCA4757”和“CCA5273”，這些不育系在低溫（＜ 23.8℃/14.3℃（晝/夜））下不結籽。世界蔬菜中心的Gniffke等[102]對5個不育系進行了評價，發(fā)現“CCA7234”和“CCA7235”2個不育系在冬季不育性表現穩(wěn)定。Gong等[103]通過種間性雜交和誘導突變相結合的方法，選育了幾個辣椒CMS系、保持系和恢復系。

為了評估Peterson的不育源的利用價值，用270個辣椒自交系與該不育源雜交，觀察后代的育性分離，Yu[96]發(fā)現，152個自交系可作保持系（（N）rfrf），66個自交系可作恢復系（（N/S）RfRf），其余的歸類為不穩(wěn)定系。經自花授粉和選擇，能選育出穩(wěn)定的保持系和恢復系[97]，不穩(wěn)定系可能是不育修飾基因的雜合系，其后代對年份或季節(jié)變化有反應。

Kim等[104]評估了辣椒熱敏感胞質雄性不育系（Milyang-A）。他們觀察到，該系在15℃以上不育，但當夜間溫度降到13℃以下時，它的繁殖能力得到恢復。在另一項研究中，200A×206B、201A×200B、201A×206B、203A×200B、206A×200B、206A×201B的自交結實率為零，6個辣椒雜種F1沒有正?；ǚ郏砻麟s種F1不育[105]。Suryawanshi、Kulkarni和 Baig[106]報告說，辣椒不育系“CMS-a（0246）”植株在不同地點都不結果。湖南省農業(yè)科學院蔬菜研究所培育的辣椒不育系8214A，具有100%的雄性不育性，良好的配合力、農藝性狀和經濟性狀，常用來進行辣椒雜交制種。

利用Gniffke等[102]選育的S-細胞質不育源，培育具有不同遺傳背景的優(yōu)良不育系，經過6代回交和篩選，選育了10個溫穩(wěn)不育系，分別是“CMS4611A”、“CMS4614A”、“CMS4622A”、“CMS4624A”、“CMS4626A”、“CMS46213A”、“CMS463D2A”、“CMS463D13A”、“CMS463D14A”和“CMS463L5A”[107]。采用SSR標記分析，對CMS的 3個 A 系“CMS4611A”、“CMS4626A”和“CMS463D13A”及其B系進行評估，篩選了覆蓋辣椒全基因組的120個SSR標記（每個連鎖群10個），這些SSR標記來自前人構建的連鎖圖譜[32,38-39,67]。結果表明，經過5個回交周期（BC5F1）的選擇，3個溫穩(wěn)型CMS的A系基因組恢復率達96%以上。這些不育系遺傳穩(wěn)定，正用于雜交育種計劃[108]。

4.2 CMS基因的標記開發(fā)和定位

從Peterson[14]報道胞質雄性不育系PI 164835后，科技人員開展了一系列分子機理研究，以揭示CMS不育的原因。利用Southern blot-RFLP分析，認為線粒體中的coxII和atp6-2基因組區(qū)域可能與C.annuum的不育有關[109]。Ψatp6-2在atp6-2的3'端的編碼區(qū)被截斷[110]，Northern blot表明，不育系和恢復系的mRNA帶型存在差異，表明atp6基因是辣椒不育的候選基因之一。Kim等[111]在不育系的coxII基因（與coxII共轉錄）的3'端，發(fā)現了一個嵌合不育相關線粒體新開放閱讀框（orf456），不育系表達約17-kDa，恢復系中該蛋白的表達水平很低。在擬南芥線粒體表達，轉化群體花粉量和雄性不育表型均存在缺陷，orf456蛋白功能得到證實[111]。說明新發(fā)現的orf456是一個強不育候選基因，可以用來鑒定辣椒CMS的不育表型。另一項研究表明，細胞色素C氧化酶活性和F1F0ATPase酶的異常可能導致了不育系的花藥敗育。Ψatp6-2基因可能導致F1F0ATPase功能紊亂，orf507控制著細胞色素C氧化酶的活性，從而導致不育系花藥敗育[112]。

Kim等[113]利用辣椒Milyang-A（S-細胞質）和Milyang-B（N-細胞質）的近等基因系，在側翼序列中獲得了2個不育基因標記，SCARatp6607標記，SCARcoxII708標記，并在18個辣椒CMS對標記準確性和可靠性進行驗證。SCARatp6標記為607 bp，來源不育系，在保持系中未擴增出該片段。coxII-SCAR為S細胞質的特異PCR片段（708 bp）。Jo等[114]用辣椒CMS系“FS4401”和自交系“Jeju”，開發(fā)了一個新的不育標記accD-U，用accD-U標記篩選CMS及保持系，僅在不育系中擴增出1 082 bp片段，保持系中沒有。因此認為選育MS系時，比Kim等[113]報道的標記更有效、更可靠、更有用。Gulyas等[115]檢測到已報道的orf456基因的轉錄本發(fā)生了改變，并命名為orf507，并對不育系植株的線粒體進行了測序。發(fā)現當PCR循環(huán)次數超過35次[116]時，orf456和atp6標記在少數辣椒保持系（B系）中被輕微擴增，這可能會影響胞質雄性不育鑒定的可靠性。利用線粒體基因組序列相關SRAP標記，Ji等[117]2014年開發(fā)了一個新的鑒定一年生辣椒胞質雄性不育的特異SCAR130標記，在不育系中產生130-bp的PCR產物，在保持系中產生140-bp的片段，沒有產生輕微擴增。結果比已報道的標記（orf507、atp6和accD-U）更可靠。SCAR130位于煙草線粒體基因組trnE和trnS之間，連鎖基因在不育系HW203A花粉敗育期（四分體期）的表達顯著高于保持系。因此推測除orf507和atp6外，CMS還可能存在其他調節(jié)因子。與辣椒CMS相關基因相關的分子標記如表3所示。

多數研究表明，CMS育性恢復是由一個可遺傳的“Rf”顯性基因決定，也不排除互補基因[124]、修飾基因[116,125]、小基因或多基因[126]、第三個單倍型的Rf位點[17]和環(huán)境因素[15,124]參與了育性恢復。Min等[16]的后續(xù)研究排除了第三個單倍型的Rf基因。

在平面作畫轉移至在立體的器型上作畫時，是需要對所展現的事物造型的進行相應的處理和調整的，對整體的布局也窯技能型重新的規(guī)劃，不然，畫面的最終效果就會不如人意。因此，在將花鳥題材的作品移至器物之上的時候，我們需要對畫面整體進行布局，這與國畫的整體格局的布置有著異曲同工之妙。然后，再對題材的造型進行一定的處理，最終才能以最好的方式呈現出畫面的美感。

Zhang等[23]應用RAPD-BSA方法，首次報道與辣椒Rf基因連鎖的RAPD分子標記。用21號牛角椒-A（rfrf）×湘潭晚（RfRf）的F2代群體，發(fā)現2個與Rf基因相關的RAPD標記，標記OP131400與該基因緊密連鎖，遺傳距離為0.37 cM，第二個標記OW19800位于對側，遺傳距離為8.12 cM，LOD值分別為46.81和23.38。OP131400為后續(xù)研究中最常用的Rf連鎖標記。Kim等[120]把OP131400RAPD轉化為OP13-CAPS， Min等[17]根據OP13-CAPS生成CaRf-M1標記。Kim等[110]和Min等[17]發(fā)現OP13-CAPS距離恢復基因位點1.1 cM，但Min等[16]顯示其距離為0.4 cM，類似于Zhang等[23]最初報告的0.37 cM。

Gulyas[119]開發(fā)了一個CRF3S1S SCAR標記，在F3和F4的群體中，距Rf位點分別為5.3和4.8 cM。Min等[16]將CRF3S1S SCAR標記轉換為CAPS標記，并確認該標記比Gulyas等[115]、Kim等[120]報道中檢測到的8個AFLP標記（AFRF1到AFRF8）更接近恢復基因位點，距離1.5 cM，后成功將1個（AFRF8）轉換為一個名為AFRF8 CAPS的CAPS標記。此外，利用TS502（rfrf）×HK6T（RfRf）的138個F2植株，構建了一個全長54.1 cM的連鎖圖譜（LOD = 4.0）, 包含1個AFRF8 CAPS、1個OP131400RAPD 和 7個AFLP 標記。AFRF8 CAPS標記位于恢復基因位點1.8 cM處，它和OP131400RAPD標記位于基因的同一側[17]。Zhang等[23]研究認為，Rf位點的側翼是RAPD標記OP131400，距離為1.1 cM，與本研究不同，可能是由于使用兩張圖譜所致，他們還試圖在辣椒“SNU2”圖譜[32]上定位AFRF8 CAPS和OP131400RAPD標記，但沒有獲得相應結果。AFRF8 CAPS衍生的CaRf-FL-M2標記位于距離CaRf-M1 標記 0.1 cM[17]。

表3 與辣椒CMS相關基因連鎖的分子標記特征

Min等[116]用辣椒雜交品種“Buja”和“Tamna”的F2群體，構建了Rf-BSA、rf-BSA和4個重組子（1個MS和3個MF）池，用于AFLP標記分析，鑒定并篩選出3個Rf連鎖分子標記AFRF1、AFRF3和AFRF4，構建了連鎖圖譜。標記AFRF4與Rf基因型和4個重組子共分離，與Rf位點的最短遺傳距離0.1 cM，位于Rf位點的對側。

Jo等[121]認為已克隆的Rf基因可作為開發(fā)辣椒Rf候選基因連鎖標記。用已克隆的矮牽牛Rf作為候選基因，利用3個BAC庫，開發(fā)了BAC13T7 SCAR（1.4 cM）、BAC17T7 SCAR（3.2 cM） 和PepPR1-as-PCR(14cM)等3個Rf連鎖標記，矮牽牛同源基因位于辣椒Rf位點附近。在已開發(fā)標記[120,125]基礎上，Gulyas等[119]開發(fā)出適用性更廣泛的CRF-SCAR標記，遺傳距離更近（1.4 cM）。與Lee等[125]比較，CRF-SCAR和OPP13-CAPS被定位在基因位點的對側。并將已開發(fā)和新開發(fā)的標記定位在辣椒AC99圖譜的6號染色體上端[42]。

為了解主效Rf基因、次效基因和溫度等環(huán)境因素的作用，Wang等[126]確定了恢復能力的數量性狀位點（QTLS）[42]，利用綜合遺傳圖譜[26]中的標記，將1個恢復主效QTLS定位在6號染色體上端末，占表型變異的20%～69%；4個次要QTLS定位在其他染色體（5號、2號，連鎖群PY3和PY1）上，占表型變異的7%～17%。Jo等[121]研究表明，OPP13-CAPS和其他Rf連鎖標記在同一區(qū)域（6號染色體的上端末），因此認為Wang等[126]報道的主效Rf和Rf-QTLS可能是同一基因。盡管開展了很多研究，Rf基因的實際圖譜位置還沒有確定。

Lee等[18]確定了CMS中影響恢復能力的相關“pr”（部分恢復）位點。主要“Rf”基因與隱性的“pr”基因共存，表現部分恢復。這種植株有正常的花藥，同時產生正常和敗育花粉，但多數花粉開裂后粘在花藥壁上，導致果實種子少，坐果率低。Lee等[125]利用768個AFLP標記進行AFLP-BSA分析，鑒定出8個Pr-連鎖AFLP引物。利用AFLP標記，對GD×HF3-SC1的87株F2后代進行篩選，在8個AFPL標記中，有2個標記E-AGC/M-GCA122和E-TCT/M-CCG116與位點最近，遺傳距離估計為1.8 cM。根據AFLP片段序列和側翼區(qū)域的序列，將E-AGC/M-GCA122轉化為 PR-CAPS標記。利用1個與pr-連鎖標記（PR-CAPS）[125]和3個Rf-連鎖標記（OPP13-CAPS[23,118]、AFRF8-CAPS[120]和CRF-SCAR[32,119]），對韓國商品辣椒“Buja”（S，Rf/rf）的205株F2進行分子生物學分析，確定部分恢復“pr”與育性恢復“Rf”基因位點的連鎖關系，發(fā)現這四個標記緊密相連，表明pr基因與Rf位點相關或是Rf位點的第三等位基因，其顯性關系為Rf ＞ pr ＞ rf[18]。

大量的種質資源評價結果表明，恢復系來源有限，大部分甜椒和相當一部分辣椒缺乏Rf基因[22-23]，制約了雜交育種中恢復系的選育。辣椒Rf及其相關基因的分子生物學研究有助于辣椒Rf/rf基因的快速篩選，無需評價雜交后代育性，從而加速rf基因、Rf基因分別在保持系、恢復系的轉育。在許多已開發(fā)的標記中，OP131400RAPD[23]、CaRf-M1[17]和AFRF4[16]與Rf緊密連鎖，位于Rf位點的對側，這些標記將在MAS發(fā)揮重要作用。在MAB育種中，運用Rf位點連鎖的SCAR標記CRF-S870（CRF3S1S）[119]，將Rf等位基因導入甜椒新基因型[127]。在另一項研究中，用10個辣椒、10個甜椒CMS系及其保持系與5個辣椒、5個甜椒恢復系，Yeh等[128]驗證了5個CMS（S細胞質）不育性（atp6-SCAR607，Ψatp6-2875，coxIISCAR708，orf456，SCAR130/140）和 1 個Rf位點恢復性（CRF-S870），在5個不育性的標記中，共顯性SCAR130/140[117]是檢測細胞質類型（S vs.N）最可靠和可重復的標記，該標記與pr基因相關[125]，將有助于選育C系，通過消除pr等位基因的影響，完全恢復不育系的育性。

Mulyantoro等[129]利用CMS相關標記，將甜椒NMS轉化為CMS。2個CMS特異不育性標記atp6SCAR和coxIISCAR[113]，2個Rf連鎖標記CRF-CAPS[119]和 BAC13T7-CAPS[121]，Mulyantoro等[130]首次將甜椒品種“GC3”NMS成功轉化為CMS。辣椒具有S細胞質和Rf等位基因，這些發(fā)現將有助于提高甜椒雜交制種產量。

Wang等[123]利用Illumina PE和PacBio技術，對辣椒CMS系“138A”及其保持系“138B”的線粒體基因組進行測序和組裝。CMS“138A”的線粒體基因組504 210 bp，比“138B”短8 618 bp；在“138A”、“138B”中鑒定出大于100個氨基酸的ORFs分別為214個、215個。138A與138B線粒體基因組結構有較大差異，存在重組和重排事件。通過比較兩個線粒體基因組，選擇了幾個可能與不育有關的ORF（orf300a、orf314a、orf262a、orf292a、orf157a、orf115b）， 其 中orf300a和orf314a是138A中控制不育的強候選基因，并開發(fā)了一個與不育性狀共分離新的標記（orf300a）。

5 雄性不育相關基因的克隆及不育系的轉錄組/蛋白質組分析

在辣椒中已經發(fā)現了一些與NMS基因相關的分子標記。但迄今為止，辣椒中NMS的分子機制尚不清楚，關于辣椒中NMS相關基因的克隆、鑒定和功能分析的報道很少。

利用一年生辣椒開展核雄性不育系“114AB”研究，發(fā)現一個花藥特異性脂質轉移蛋白（LTP）基因CaMF2影響花粉發(fā)育[132]。采用cDNA-AFLP，首次鑒定和描述了1個新的雄性不育相關基因Camf1，編碼乙二醛氧化酶相關蛋白[133]。表達分析表明，CaMF2和Camf1基因只在可育株已發(fā)育的花藥中表達，而在不育株中不表達，說明這些基因可能在花粉發(fā)育中起重要作用。CaMF2和Camf1的抑制或缺失可能導致辣椒不育。Camf1的長度為1 854 bp，不包含1 707 bp ORF的內含子。Chen等[132-133]有關CaMF2和Camf1的研究為理解辣椒中NMS的分子機制提供了一種途徑。此后，使用相同的NMS系（114AB），Hao等[134]克隆并鑒定了一個新的乙酸異戊酯水解酯酶（IAH1）基因CaMF3，該基因僅在發(fā)育后期的花蕾和可育辣椒株的開放花中表達，表明CaMF3參與了后期花粉發(fā)育，在花粉成熟和萌發(fā)過程中起一定作用。此外，對CaMF3的研究有助于進一步了解花藥發(fā)育的分子機制以及IAH1基因家族在辣椒花藥或花粉發(fā)育中的作用。Chen等[135]利用RNA-Seq技術對辣椒核雄性不育株和可育株進行全基因組轉錄分析，用于確定花粉發(fā)育和成熟的候選基因。為了進一步研究與花粉發(fā)育相關的基因，Hao等[136]在辣椒中克隆并鑒定了一個新的花藥特異基因CaMF4。

細胞質雄性不育和育性恢復的分子機制仍不清楚。Liu等[137]利用NGS技術，對辣椒CMS的“121A”和 “121C”之間的差異進行轉錄組測序和從頭分析，找出與MS相關的關鍵基因和途徑。以恢復系為參考，鑒定出4 326個上調單基因（在不育系“121A”中高表達）和7 061個下調單基因（在恢復系“121C”中高表達）。許多差異表達的單基因代表了一組與花粉形成或敗育相關的潛在候選基因。在進一步的富集分析之后，確定了三條富集途徑，覆蓋了差異最豐富的單基因。

為了從蛋白質組水平上揭示辣椒細胞質雄性不育的分子機制，Zhang等[138]利用透射電鏡（TEM），研究不育系FS1030A及其保持系FS1030B在小孢子母細胞敗育過程中的花藥蛋白質組。與細胞質雄性不育或導致細胞質雄性不育相關的蛋白質通常在MS系中表現出較低或較高的表達。在檢測到的全部蛋白質點中，有13個蛋白（7個上調，6個下調）在“FS1030A”和“FS1030B”中有差異表達。此外，使用國家生物技術信息中心（NCBI）的綠色植物和辣椒數據庫，13個蛋白點中有12個被鑒定為9個單獨的蛋白，天冬氨酸蛋白酶的過度表達導致了正常的程序性細胞死亡（PCD），導致FS1030A不育。這是第一次用蛋白質組學方法研究辣椒CMS。Guo等[139]利用“無標記”高通量蛋白質組學方法，對辣椒CMS的不育系及其保持系的表達譜進行比較，以揭示辣椒CMS的潛在機制。鑒定和定量了324種差異豐富蛋白質（DAPS），其中47種和140種分別在A系中向上和向下積累。此外，在CMS A系和B系中分別特異性地積累了75種和62種蛋白質。花粉外壁形成、三羧酸循環(huán)（TCA）、線粒體電子傳遞鏈（mtETC）、丙酮酸代謝過程和氧化應激反應中所涉及的蛋白質種類在A和B系之間存在差異積累，表明它們在辣椒花粉敗育的調控中具有潛在的作用。

為了解雄性不育的機制，Qiu等[140]采用RNA-Seq方法對不育系“8214A”及其保持系“8214B”進行比較轉錄組分析。共有1 355個基因被確定有差異表達，“8214A”和“8214B”在減數分裂期間花藥中相關基因表達水平有差異，有424個和931個上調和下調基因。20個泛素連接酶和3個細胞周期相關基因的表達水平在減數分裂過程中被強烈下調，甲基轉移酶基因在“8214A”花藥中表達上調，可能導致“8214A”花粉母細胞在減數分裂中程序性死亡，結果有助于揭示CMS辣椒花粉敗育的分子機制。

Li等[141]克隆辣椒線粒體ATP合成酶6kDa亞基（MtATP6），認為“Milyang-A”細胞質雄性不育可能是由于MtATP6活性降低引起的，因為較少的ATP含量可能影響了細胞質雄性不育植株的花粉發(fā)育，這可能是由核編碼的MtATP6和線粒體Orf507之間的相互作用引起的。Livingstone等[29]對 NuMex RNaky（RNaky）（C.annuum）和PI159234（CA4）（C.chinense）雜交的 70株 F2進行研究，將MtATP6定位在4號染色體NP1234和TG1324標記之間區(qū)域。

6 雜交種子遺傳純度檢測

明確品種的一致性、特異性和穩(wěn)定性，對保護育種人員的權益和有效控制種子質量具有重要意義。這些控制措施旨在驗證指定的雜交已經發(fā)生，母本自花授粉或同胞授粉數量符合必要的純度要求，種子活力符合標準[142]。

雄性不育系已在辣椒雜交制種應用。在印度等一些國家，NMS已在辣椒雜交種子生產上廣泛應用[81-83]。正如之前討論過，NMS有育性分離，需要盡早拔除可育植株。CMS受環(huán)境因素影響，特別是低溫影響[14-15,124]。這兩種情況都會導致雜交種子受親本自花或同胞花授粉的影響。因此，為了保證雜交種子的純度，需要開發(fā)高通量評價系統(tǒng)。

種子純度一般通過田間生長遺傳特性（GoT）或分子標記來判斷，后代表現隱性性狀，一般認為是自花授粉的結果。Jang等[143]、Mongkolporn等[144]認為 GoT鑒定在時間、成本和復雜性方面有許多缺點。由于品種間和品種內的遺傳多樣性有限，品種內的形態(tài)標記很難識別[142]。與此相反，分子標記數量眾多，且與環(huán)境效應無關。

利用RAPD、RFLP、SCAR、SNP和STS等多種PCR標記對雜交種進行親本鑒定和遺傳純度檢測。Jang等[143]考慮了6個標準：準確度、再現性、快速性、成本效率、簡單性和實用性，以解決雜交種純度測試的現有缺陷。盡管RFLP標記具有更好的多態(tài)性和穩(wěn)定性[145]，但由于其高成本和復雜性，在常規(guī)商業(yè)檢測中具有局限性[146]。在眾多用于品種鑒定和純度檢測的分子標記中，由于RAPD具有顯性遺傳，父本特異性標記有助于雜種純度檢測,同時具有成本低、使用方便等優(yōu)點，RAPD是成為最常用的一種方法。

Ballester和de Vicente[142]首次報道了用RAPD標記檢測辣椒雜交種子純度。篩選100對引物，其中“OPV-06”為檢測5個雜交種純度的最有效引物。Choe等[147]同時使用RAPD標記和磷酸葡萄糖變位酶（PGM）同工酶分析進行親本鑒定和種子純度檢測，認為用高純度的親本作參考，通過比較RAPD，可以進行F1純度檢測。Jang等[143]開發(fā)了2個RAPD標記，UBC336700作為母本特異性標記，UBC147850作為父本特異性標記，并將其轉化為基于PCR的SCAR標記。在盲試中，RAPD和SCAR標記能夠可靠地檢測出非本品種。Kumar等[22]利用Rf-連鎖 RAPD標記（OW 19 800和OP 131 400）對“CCA 4261”דPusa Jwala”進行雜交純度檢測，這兩個標記都是父本的特異性標記，很容易檢測自交后代。

SSR標記具有高度變異性、共顯性遺傳、多等位性、重復性和良好的基因組覆蓋率。一個單一的多態(tài)性標記足以檢測來自其親本的污染，兩個或多個標記檢測雜交種子的外源污染更為有效[148]。然而，目前SSR標記尚未用于辣椒種子純度的檢測。

7 總結

NMS系和CMS系均已用于辣椒雜交育種。為了加強雜種優(yōu)勢育種，MAS對促進親本選育具有重要意義。在所鑒定的20個NMS基因中，只有ms1、ms3、ms8、ms10、msk、msc-1和一個未鑒定的基因的標記被開發(fā)出來。除ms1、ms3、ms8、ms10和未鑒定的基因外，其他基因位點尚不清楚。最近報道的辣椒連鎖圖譜和全基因組測序將加速基因的標記和定位。這些緊密連鎖的標記將有助于通過MAS選育NMS系。線粒體基因atp6是辣椒細胞質雄性不育的候選基因。在辣椒CMS相關基因中，Rf是研究最多的一個。該基因已定位在第6號染色體上，但尚未克隆?；蚓氉鲌D將定位重疊或更接近位點的標記，有利于辣椒種質資源的快速篩選，加速rf基因、Rf基因分別在保持系、恢復系中的轉育。甜椒Rf基因稀缺，CMS相關標記有助于甜椒優(yōu)良的NMS轉育為CMS系，這將提高雜交育種效率和雜交種子純度。