張忠輝，高閃電*，獨軍政，田占成，王建東，殷宏,3*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染導(dǎo)致的動物疫病，呈世界性分布[1]。該病主要發(fā)生于牛，可出現(xiàn)高熱、腹瀉、白細(xì)胞減少、沉郁、流涎、減奶、停奶、結(jié)膜炎、口腔黏膜充血潰瘍、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎等多種臨床癥狀，還可由于持續(xù)感染導(dǎo)致免疫耐受和免疫抑制。鑒于該病導(dǎo)致的嚴(yán)重經(jīng)濟損失，世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定報告的牛傳染性疾病之一，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列為三類動物疫病。

BVDV在分類學(xué)上屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)，為單股正鏈RNA病毒[2]。成熟的病毒粒子為球形，直徑40～60 nm，其核衣殼位于病毒粒子的中央，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)雙層包裹C蛋白和病毒基因組RNA構(gòu)成。BVDV基因組全長12.3～12.5 kb，只有一個開放閱讀框，編碼一個由約4 000個氨基酸組成的多聚蛋白，在翻譯同時或翻譯后經(jīng)細(xì)胞和病毒基因編碼的蛋白酶加工為11或12種蛋白，其中P14(C)、gP48(Erns)、gP25(E1)、gP53(E2)4個蛋白為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其余為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。C蛋白是病毒編碼的第二個蛋白，分子質(zhì)量為14 kDa，是一種小的堿性多肽，主要功能是結(jié)合病毒基因組RNA并形成核衣殼，在保護病毒基因組RNA方面起重要作用。研究表明，同屬的豬瘟病毒C蛋白還具有參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[4]、影響病毒毒力[5-6]、拮抗病毒增殖等作用[7]。為了進一步研究C蛋白在BVDV感染中起的重要作用，本研究利用原核表達系統(tǒng)進行高效表達獲得重組C蛋白，并制備了兔源多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒株、載體、細(xì)胞及實驗動物

克隆用pGEM-T easy載體購自Promega公司。原核表達載體pET42a(+)購自Novagen公司?？寺【闐H5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程(大連)有限公司。表達工程菌株BL21 Rosetta (DE3) pLysS購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實驗所用病毒株BVDV-AV69 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。牛腎細(xì)胞(MDBK)細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜病原生物學(xué)國家重點實驗室并保存。8周齡新西蘭白兔購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司。PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)、內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；預(yù)染蛋白Marker，購自Solarbio公司；GST·Bind蛋白質(zhì)純化試劑盒購自Novagen公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自Abcam公司。SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。兔抗 BVDV全病毒陽性參考血清和陰性血清，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室制備保存；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成

參照GenBank公布的BVDV基因組序列，設(shè)計一對特異性引物，F(xiàn)：5′-CATGGATCCTCCGACACAAATGCAGAAG-3′、R：5′-GACAAGCTTTCCCACTGCAACCTGAAAC-3′，用于擴增BVDV C基因，預(yù)期片段大小為306 bp，委托西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 BVDV總RNA的提取及RT-PCR擴增

根據(jù)RNeasy Mini Kit試劑盒說明書，提取BVDV總RNA。以提取的RNA為模板，進行RT-PCR，RT-PCR擴增反應(yīng)體(50 μL)包括：Primer F：1.5 μL，Primer R：1.5 μL，Enzyme Mix：2 μL，2×1 Step Buffer：24 μL，RNA：4 μL，RNase free H2O：17 μL；PCR反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；94 ℃ min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，35 s；35個循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃，1 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測鑒定。

1.2.3 基因克隆

膠回收PCR產(chǎn)物，與克隆載體pGEM-T easy于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個克隆利用M13F/R引物進行PCR鑒定，將初步鑒定正確的菌落用氨芐LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.4 C基因表達載體的構(gòu)建

分別將測序正確的pGEM-T easy-C和表達載體pET42a用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA Ligase連接于16 ℃過夜，轉(zhuǎn)化BL21 Rosetta (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞，搖菌并提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒pET42a-C送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.5 蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

將篩選到的pET42a-C陽性重組菌，擴大培養(yǎng)至OD600nm達到0.6時，加入終濃度為1 mM的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，6 000 r/min離心10 min，收集菌體進行超聲波破碎，功率150 W超聲時間30 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測表達情況。確定蛋白表達后，以同樣的方法誘導(dǎo)500 mL重組菌，超聲裂解后，以GST樹脂親和層析法對上清中的目的蛋白進行純化并進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blot分析

將純化獲得的重組C蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別以兔抗BVDV陽性參考血清(1∶1 000)和兔陰性血清(1∶1 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗5次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶15 000)作用1 h，PBST洗5次，每次5 min，之后加入SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，利用BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.7 多克隆抗體的制備

將純化的C蛋白與弗氏完全佐劑等比例混合后乳化成油乳劑，經(jīng)腘淋巴結(jié)和背部皮下多點注射免疫2只雄性白兔，免疫的抗原用量為100 μg。2周后以相同抗原用量的重組C蛋白與弗氏不完全佐劑經(jīng)乳化后進行二免。二免2周后以相同抗原進行三免。三免結(jié)束10 d后經(jīng)心臟采血，分離血清，備用。

1.2.8 多克隆抗體的鑒定

多克隆抗體效價測定：以純化的重組C蛋白100 μL(濃度為0.5 μg/mL)包被ELISA反應(yīng)板，進行間接ELISA對多克隆抗血清進行效價測定。將兔抗C蛋白多克隆血清、免疫前的兔陰性血清分別進行1∶100～1∶25 600倍比稀釋，以1∶10 000倍稀釋辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，以TMB為底物顯色液，以免疫血清OD450 nm值/陰性對照血清OD450 nm值大于等于2為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

間接免疫熒光(IFA)檢測抗體反應(yīng)性：將MDBK細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔用500 TCID50的BVDV-AV69 接種，36 h后用無水乙醇固定30 min，PBS清洗后分別加入1∶200稀釋的C蛋白多克隆抗體和陽性對照血清、兔陰性對照血清，37 ℃孵育1 h；用PBS清洗5遍后以1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃下孵育1 h。用PBS清洗5遍后，吸干并用甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察，判定多克隆抗體與BVDV天然抗原的反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 C基因RT-PCR擴增

經(jīng)RT-PCR擴增，利用3 %瓊脂糖凝膠電泳后，在位于306 bp處可見與預(yù)期結(jié)果大小一致的擴增條帶(圖1)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000 Marker；1. C基因

圖1 C基因RT-PCR擴增

2.2 表達載體的構(gòu)建

利用BamHⅠ和HindⅢ將C基因定向克隆至載體pET-42a表達載體中，轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進行PCR鑒定，獲3個陽性克隆(圖2)，提取質(zhì)粒測序表明重組表達載體具有正確的讀碼框。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1-5. 菌液PCR擴增產(chǎn)物；6. 陽性對照；7. 陰性對照

圖2 重組質(zhì)粒pET-42a-C的PCR鑒定

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和純化

將測序正確的重組菌株，經(jīng)擴大培養(yǎng)至菌液OD600nm值達到0.6時加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG后誘導(dǎo)，8 h后收集菌體超聲波破碎菌體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，重組C蛋白以可溶形式表達，經(jīng)純化得到分子質(zhì)量約45 kDa的目的蛋白(圖3)。

2.4 重組蛋白的免疫印跡檢測

Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白可與BVDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與陰性血清未見反應(yīng)(圖4)。

M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)；2. 誘導(dǎo)2 h；3. 誘導(dǎo)4 h；4. 誘導(dǎo)6 h；5. 超聲后沉淀；6. 超聲后上清；7. 純化的C蛋白

圖3 重組C蛋白的表達和純化

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的蛋白與陽性血清作用；2.純化后的蛋白與陰性血清作用

圖4 重組表達蛋白的Western blot分析

2.5 多克隆抗體效價的測定

ELISA結(jié)果表明(圖5)，當(dāng)血清稀釋度達到25 600時，兩兔抗C蛋白多克隆抗體在OD450 nm值分別為1.592和1.611，明顯高于陰性對照兔血清的OD450 nm值，說明成功制備了抗C蛋白多克隆抗體，其效價可以達到1∶25 600以上。

A. 抗C蛋白家兔血清; B. 抗C蛋白家兔血清; N.免疫前家兔血清

圖5 間接ELISA法測定兔C蛋白多克隆抗體的效價

2.6 間接免疫熒光試驗

MDBK細(xì)胞接種BVDV 36 h后，利用制備的多克隆抗體(圖6A)和陽性血清(圖6B)進行間接免疫熒光試驗，可檢測到特異的熒光，而未接種病毒的MDBK細(xì)胞中未見熒光信號(圖6C)，表明制備的兔抗C蛋白多克隆抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中的BVDV天然抗原具有良好的反應(yīng)原性。

A. 本研究制備的多殼隆抗體；B.陽性參考血清對照；C.陰性血清對照

3 討論

BVDV的衣殼蛋白基因編碼102個氨基酸，在BVDV多聚蛋白加工過程中，N蛋白由于自我切割從C蛋白N端解離，之后多聚蛋白在C蛋白C端信號序列介導(dǎo)下轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)由信號肽酶進行C蛋白和Erns蛋白的切割[8]。信號肽酶進一步切割除去膜錨定序列后產(chǎn)生90個氨基酸組成的成熟C蛋白。成熟的C蛋白與病毒基因組結(jié)合，并由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的蛋白形成囊膜，與Erns蛋白、E1蛋白以及E2蛋白組裝成病毒粒子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)轉(zhuǎn)運并最終通過細(xì)胞分泌途徑釋放至胞外[9]。C蛋白在瘟病毒屬比較保守，除了結(jié)合病毒基因組RNA形成核衣殼，目前發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒C蛋白還可與宿主SUMO化通路蛋白作用影響病毒毒力、與血紅蛋白β亞基相互作用拮抗病毒增殖[7]，但尚不清楚BVDV C蛋白是否具有類似的功能。為了進一步研究BVDV C蛋白的功能，本研究選用原核表達系統(tǒng)進行了C蛋白的表達。谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)來源于日本血吸蟲，其基因融合表達體系具有蛋白表達產(chǎn)率高、表達產(chǎn)物純化方便以及利于抗體制備等優(yōu)點[10]，而且該蛋白在哺乳動物細(xì)胞并無表達，因此在純化后我們并未切除GST標(biāo)簽。前期研究發(fā)現(xiàn)，去除NADL毒株C蛋白C端13個氨基酸序列有利于其在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達，但去除C端10個氨基酸的Erns信號肽序列進行蛋白表達并不能獲得足夠的可溶性蛋白[11]。在本研究中，表達完整的C蛋白獲得了理想的表達量，這可能由于所用毒株基因和載體不同，導(dǎo)致目的基因的表達量存在一定差異。為了獲得針對完整C蛋白的多克隆抗體，本試驗并未去除C蛋白C端的氨基酸。免疫印跡證實純化所獲C蛋白具有良好的反應(yīng)原性，在免疫后獲得具有較高效價的兔源多克隆抗血清。由于C蛋白抗體不具中和病毒的活性，本研究采用了間接免疫熒光試驗的方法驗證了所獲單克隆抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒天然抗原的反應(yīng)活性。目前，BVDV的衣殼蛋白諸多的功能，包括其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運途徑、通過與宿主蛋白互作調(diào)控病毒感染等，有待于深入研究。本研究成功制備了BVDV C蛋白多克隆抗體，從而為后續(xù)C蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。