雷宇杰,劉開放,黃榮靜,李崢*

(1. 信陽農(nóng)林學院，河南 信陽 464000；2. 河南省現(xiàn)代漁業(yè)生物工程技術研究中心，河南 信陽 464000)

茶多酚(tea polyphenols，TP) 又名茶單寧、茶靴質，是茶葉中多酚類物質的總稱。茶多酚為淡黃至茶褐色略帶茶香的水溶液、粉狀固體或結晶，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯，微溶于油脂[1-2]。耐熱性及耐酸性好，在pH2～7范圍內均十分穩(wěn)定。茶多酚具有抗氧化作用、增強免疫、預防疾病、提高應激等作用，在各個領域已被廣泛應用[3-5]。近年來，茶多酚作為飼料添加劑在水產(chǎn)動物的研究受到學者們的關注。梁高楊等[6]在飼料中添加200～400 mg/kg茶多酚飼喂奧尼羅非魚，能顯著提高其免疫性能，降低嗜水氣單胞菌攻毒后的死亡率，對生長性能沒有顯著影響；徐奇友等[7]在飼料中添加25～100 mg/kg茶多酚飼養(yǎng)虹鱒，顯著提高了肝臟免疫酶活性；龍萌[8-9]等用含50～100 mg/kg茶多酚的飼料飼喂團頭魴幼魚，顯著提高了增重率和肝臟抗氧化能力，并降低了魚體感染嗜水氣單胞菌后的死亡率。

馬口魚(Opsariichthysbidens)俗名花杈魚、桃花魚，為小型雜食性經(jīng)濟魚類，游動敏捷，善跳躍，是城市休閑漁業(yè)特別是“黑坑”主要引進的品種。馬口魚的研究主要集中在規(guī)?；斯し敝臣夹g上[10-12 ]，對于養(yǎng)殖中出現(xiàn)的疾病防控研究幾乎沒有。受水體污染及高密度養(yǎng)殖等環(huán)境應激的脅迫，如何提高馬口魚免疫力已成為現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是集約化養(yǎng)殖考慮的焦點問題[13-15]。本試驗選用馬口魚作為研究對象，在飼料中添加不同水平的茶多酚，考察其對馬口魚生長性能、免疫性能及環(huán)境脅迫下抗病力的影響，為茶多酚在馬口魚的養(yǎng)殖及茶葉的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

在基礎飼料中分別添加0(對照組)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g/kg的茶多酚，共配成6種試驗飼料?；A飼料見表1。

1.2 試驗魚與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗在校外實訓基地東雙河養(yǎng)殖專業(yè)合作社的戶外池塘進行，設置18口網(wǎng)箱于塘內，每個網(wǎng)箱的規(guī)格為120 cm×120 cm×140 cm，試驗所用馬口魚購于開平市水口鎮(zhèn)紅花魚苗場。正式試驗前，將馬口魚暫養(yǎng)于大網(wǎng)箱中，期間投喂基礎飼料使其適應試驗環(huán)境。馴養(yǎng)2周后，選取體格健壯、規(guī)格均一、平均體質量為(7.5±0.3)g的馬口魚360尾進行試驗，隨機分成6組，每組3個重復，每個重復20尾魚。養(yǎng)殖試驗的18口網(wǎng)箱置于一個池塘中，養(yǎng)殖周期為8周。養(yǎng)殖期間定時飽食投喂3次，每日觀察并記錄魚攝食和死亡情況，根據(jù)水溫、攝食情況進行調整，使各網(wǎng)箱投喂飼料均能保證在15 min內吃完，無殘餌。試驗期間水溫為21～35 ℃，pH值為7.0左右，溶解氧含量大于5.5 mg/L，氨氮含量小于0.01 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結束后將魚饑餓24 h，以排空腸道內容物，對每個網(wǎng)箱試驗魚尾數(shù)統(tǒng)計并稱重，統(tǒng)計每組的成活率、增重率。

表1 馬口魚基礎飼料配方和營養(yǎng)水平(干物質) %

注：①飼料原料購自開封海大飼料公司，原料中粗蛋白含量如下：魚粉64.24 %，豆粕44.16 %，菜籽粕35.65 %，米糠12.69 %，次粉14.28 %，玉米9.2 %；

②維生素預混料為每千克飼料提供：維生素A為10 mg，維生素D3為4 mg，維生素E為250 mg，維生素k3為19 mg，維生素B1為20 mg，維生素B2為20 mg，維生素B3為45 mg，維生素B5為50 mg，維生素B6為30 mg，葉酸為3 mg，維生素B12為0.05 mg；

③礦物質預混料為每千克飼料提供：錳200 mg，鐵為450 mg，鋅150 mg，銅30 mg，鎂150 mg，碘4 mg。

血清采集：每口網(wǎng)箱隨機取4尾馬口魚，用一次性1 mL的無菌注射器尾部靜脈采血，置于2 mL離心管內，離心機(3 000 r/min)離心10 min后取上清液，將同一網(wǎng)箱中采集的血清混勻后，分裝于0.5 mL的離心管內，每口網(wǎng)箱分裝12管血清，保存于-80 ℃冰箱中，用于測定血清指標。

1.4 生長指標

養(yǎng)殖試驗結束時，禁食24 h，每尾網(wǎng)箱隨機取3尾魚，測量體重體長，解剖取內臟和肝臟，稱重用于計算形體指標。指標計算公式如下：

增重率(WGR，%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；

成活率(SR，%)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)；

肝體指數(shù)(HIS，%)=100×肝臟重/體重；

臟體指數(shù)(VSI，%)=100×內臟重/體重；

肥滿度(CF，g/cm3)=100×體重/體長3。

1.5 全魚常規(guī)成分分析

將稱重的試驗魚，每口網(wǎng)箱隨機取3尾魚，將魚體稱重后置于培養(yǎng)皿中，在105℃的烘箱中烘至恒重后計算得到水分含量(GB 5009.3-2016)；粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(全自動凱氏定氮儀，kjeltee-2300,福斯有限公司，瑞典)(GB 5009.5-2016)。粗脂肪含量測定采用索氏抽提法(GB 5009.6-2016)；粗灰分含量的測定采用550 ℃馬弗爐灼燒法(GB 5009.4-2016)。

1.6 血清免疫指標的測定

血清超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYZ)、丙二醇(MDA)、過氧化氫酶(CAT)的活性測定使用南京建成生物工程研究所所生產(chǎn)的生化試劑盒測定。

南京建成生物工程研究所試劑盒測定SOD的活性。血清中SOD活力單位定義：每毫升反應液中SOD酶活單位(U)。測定LYZ原理：在一定濃度的混濁液中，由于LZM能水解細菌細胞壁上的肽聚糖使細菌裂解，體系濃度降低，透光度增強，根據(jù)透光度變化推測LYZ含量(1 μg=80 U)。MDA含量測定采用黃嘌呤氧化酶法。CAT活性測定采用鉬酸銨法。

1.7 攻毒試驗

飼喂試驗結束后，每組隨機選取20尾魚，每組設置2個重復(10尾/重復)，分別飼養(yǎng)在標記好的小型水族箱中，保持水溫恒定。所用試驗魚腹腔注射濃度為50倍半數(shù)致死劑量(LD50)(1.57×108CFU/mL)的假單胞菌菌液，每尾0.2 mL。連續(xù)觀察15 d，記錄各組試驗魚的死亡情況，計算存活率。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0分析軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，結合Duncan氏多重比較檢驗法進行組間差異顯著性比較，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 TP對馬口魚生長性能和形體指標的影響

TP對馬口魚生長和形體指標的影響見表2。經(jīng)過8周的養(yǎng)殖試驗，各組試驗對象生長良好，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。其中0.2、0.4和0.6 g/kg組增重率顯著高于對照組和其他試驗組(P<0.05)；在形體指標方面，0.2～0.8 g/kg組的肥滿度顯著高于對照組(P<0.05)，肝體指數(shù)和臟體指數(shù)各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

表2 TP對馬口魚生長指標和形體指標的影響

項目指標茶多酚添加量/(g·kg-1)0(對照組)0.10.20.40.60.8初始均重/g7.57±0.127.71±0.067.68±0.117.48±0.077.45±0.217.54±0.05終末均重/g33.78±6.0335.33±3.8340.83±7.5239.27±8.8139.01±3.2735.89±4.34增重率/%346.24±2.56a358.23±2.31ab431.64±3.36c425±4.43c423.62±2.06c373.34±3.04b成活率/%100100100100100100肝體指數(shù)/%1.83±0.181.88±0.031.80±1.011.84±0.081.84±0.061.85±0.07臟體指數(shù)/%7.29±0.137.28±0.097.32±0.087.33±1.127.29±0.177.31±0.56肥滿度/g/cm31.34±0.08a1.35±0.07a1.42±0.13b1.43±0.13b1.43±0.09 b1.42±0.11b

注：同一行數(shù)據(jù)上標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 TP對馬口魚體成分的影響

TP對馬口魚體成分的影響見表3。與對照組相比，飼料中添加TP可降低體組織中脂肪的含量，特別是0.2 、0.4、0.6和0.8 g/kg組降低較為顯著(P<0.05)。全魚水分、粗蛋白含量和粗灰分含量各組之間無顯著差異。

表3 TP對馬口魚體成分的影響

項目指標茶多酚添加量/(g·kg-1)0(對照組)0.10.20.40.60.8水分76.22±0.1376.98±0.2277.03±0.2576.58±0.3676.48±0.1777.13±0.28粗蛋白質18.36±0.1518.72±0.1418.66±0.1818.48±0.2218.76±0.0817.98±0.31粗脂肪1.81±0.21a1.70±0.11ab1.65±0.13b1.63±0.18b1.62±0.23b1.60±0.28b粗灰分1.28±0.081.29±0.971.30±0.231.29±0.731.28±0.321.29±0.19

2.3 TP對馬口魚血清免疫指標的影響

TP對馬口魚血清免疫指標的影響見表4。與對照組相比，飼料中添加0.4、0.6和0.8 g/kg TP均能顯著提高SOD、CAT、LYZ的活性；血清中MDA含量則出現(xiàn)先降低后升高的變化，其中以0.4 g/kg組變化最為明顯。

表4 TP對馬口魚血清免疫指標的影響

項目指標茶多酚添加量/(g·kg-1)0(對照組)0.10.20.40.60.8SOD(U/mL)60.56±1.23a82.45±0.56b103.21±1.86c110.78±2.13c106.25±2.57c98.73±3.91bcCAT(U/mL)1.56±0.23a2.05±0.09b 2.06±0.36b 3.28±0.56c 3.3±0.63c3.53±0.49cLYZ(U/mL)106.67±1.23a 168.58±2.45b 179.79±2.56b199.87±4.21c203.82±2.59c208.95±2.16c MDA(nmol/mL)9.56±1.11a8.82±0.94ab 7.21±1.72b 6.89±1.62c 6.56±1.42c6.62±0.95c

2.4 TP對病原菌感染后馬口魚死亡率的影響

病菌感染試驗結果顯示(圖1)，6組試驗對象的存活率在第15天時存活率分別為5%、30%、55%、55%、60%和60%，5個試驗組的存活率與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 攻毒后各組的存活情況

3 討論

3.1 TP對馬口魚生長性能和體成分的影響

目前，TP作為食品添加劑和飼料添加劑被廣泛應用于各個行業(yè)，近年來在水產(chǎn)養(yǎng)殖上也受到重點關注。在茶多酚能否促進魚體生長，各研究者的結果不一：徐禛等[16]用兒茶素飼喂草魚，對草魚的生長沒有顯著影響，但增加了其肥滿度；梁高楊等[6]在飼料中添加100～800 mg/kg茶多酚后，結果發(fā)現(xiàn)對羅非魚生長性能無顯著影響；龍萌等[8]發(fā)現(xiàn)飼料中添加50 mg/kg和100 mg/kg茶多酚，顯著提高團頭魴增重率和特定生長率；劉振興等[17]發(fā)現(xiàn)飼料中添加166 mg/kg茶多酚可顯著提高羅非魚的生長性能；同樣地，李金龍等[18]在飼料中添加50 mg/kg茶多酚，可顯著提高青魚的生長性能。

本試驗中，在飼料中添加0.1～0.8 g/kg茶多酚后，結果發(fā)現(xiàn)其特定生長率出現(xiàn)先增高后降低的趨勢，且在0.8 g/kg添加組較在0.2～0.6 g/kg添加組顯著下降，這說明一定劑量的茶多酚可以促進馬口魚的生長。對比其他學者的研究，茶多酚在促進魚類生長性能的研究結果中各有差異，分析這可能與魚的種類、飼料、茶多酚的含量等各方面有一定的關系。肥滿度指標可以衡量魚體的生長及營養(yǎng)健康情況，也是檢查魚體對外界環(huán)境的適應能力和飼料飼喂效果的的重要方法。本試驗馬口魚的肥滿度指標與增重率呈正相關關系，在一定程度上，也驗證了TP可以促進生長性能的提高。通過體成分的分析，0.1～0.8 g/kg的TP可顯著降低體組織中脂肪的含量，從另一個側面驗證了TP添加可促進魚體健康水平。通過對這三個指標的判定，初步認為馬口魚飼料中TP的適宜添加水平為0.2～0.4 g/kg。

3.2 TP對馬口魚抗氧化性指標、非特異性免疫指標及抗病力的影響

魚類和人類一樣，在呼吸和代謝過程中會產(chǎn)生氧自由基，及時清理機體過量自由基可降低機體的氧化損傷程度，SOD、CAT是機體重要的抗氧化能力酶，在機體的氧化和抗氧化平衡中發(fā)揮重要作用。本試驗中，添加0.4、0.6和0.8 g/kg均能顯著提高SOD、CAT的活性。MDA為機體內脂質過氧化的產(chǎn)物，其含量的多少能間接反映出氧自由基的含量及機體細胞脂質過氧化的程度。隨著TP添加水平的提高，斑點叉尾鮰[19]、草魚[16]等的血清中MDA均呈下降趨勢。本試驗中，添加0.4～0.8 g/kg TP可顯著降低馬口魚血清中MDA含量，與上述的研究結果相一致。LYZ是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解，從而起到抗菌效果。體內LYZ活性是魚類非特異性免疫的重要指標，有助于魚類抵抗水域中各種病原的侵襲。梁高楊等[6]在飼料添加200～800 mg/kg的茶多酚顯著提高了奧尼羅非魚血清中LYZ活性；在飼料中添加1%～5%綠茶提取物，增強了許氏平鮋血漿中LYZ活性[20]。本試驗中，添加0.4～0.8 g/kg能顯著提高機體的LYZ活性，提高魚類的免疫力。以上4個指標的測定結果顯示，TP對馬口魚血清中抗氧化指標和免疫力提高是顯著的，后期進行的攻毒試驗表明，0.2～0.8 g/kg的TP添加量組存活率顯著高于對照組，這些研究結果說明TP的添加可以提高魚體抗氧化能力和非特異性免疫，同時可提高對病原菌的抑制作用。

4 結論

在基礎飼料中添加TP可促進馬口魚的生長，增強魚體抗氧化能力和抗病原菌的感染力。綜合生長性能和抗病力分析，馬口魚幼魚飼料中茶多酚適宜添加量為0.2～0.4 g/kg。