梁棟，孫若琳，施其成，孟振祥，成艷芬，朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實驗室，江蘇 南京 210095)

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，粗飼料產(chǎn)量每年可達(dá)數(shù)億噸。但當(dāng)粗飼料得不到合理的利用(如焚燒、土埋等)時將會對環(huán)境造成污染并且造成資源浪費[1]。粗飼料是谷物在收割時產(chǎn)生的農(nóng)副作物，主要包括麥秸、稻秸、玉米秸稈等。粗飼料中粗纖維含量較高，粗蛋白含量較低，由于半纖維素與木質(zhì)素的共價鍵結(jié)合使粗飼料的適口性比較差[2]。

血液是遍布全身各大組織和器官周圍的一種流體組織，機體大部分的新陳代謝過程都有血液的參與，血液主要由血清和血漿兩大部分組成，兩者都能夠反映機體的代謝情況[3]。生物機體的復(fù)雜性大大限制了常規(guī)的檢測技術(shù)對機體內(nèi)潛在的分子機制的探究，也增加了清晰精確的挖掘深層信息的困難性，而代謝組學(xué)技術(shù)恰恰解決了這些問題[4-5]。研究粗飼料對反芻動物血液代謝的影響，可以幫助了解粗飼料在動物體內(nèi)的降解和吸收過程，為提高反芻動物粗飼料利用率提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本試驗以湖羊為試驗動物，研究飼喂麥秸對湖羊血液代謝的影響，以期了解麥秸對湖羊營養(yǎng)物質(zhì)代謝與吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和日糧設(shè)計

試驗選取12只體重40 kg左右的健康公湖羊，單籠飼養(yǎng)，預(yù)飼30 d后，隨機分為2組，每組6只，一組飼喂麥秸，另一組飼喂苜蓿。正式試驗期為3周，每日飼喂2次，早晨8:00和下午5:00飼喂，自由采食和飲水。日糧設(shè)計參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[6]。精粗比為6∶4，日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物房實施，試驗前進(jìn)行動物房的全面清理和消毒。

表1 飼料組成和營養(yǎng)水平 kg

注:每千克預(yù)混料包含維生素A (60～75)kIU，維生素D (31～15)kIU，維生素 E≥50 mg，硫酸銅 150～500 mg，硫酸鋅 100～1 400 mg，硫酸鐵 300～800 mg，硫酸錳 200～1 000 mg。

1.2 樣品采集和處理

于正式飼養(yǎng)期的第0、7、14及21天的晨飼前，取湖羊頸部血液。血液樣品放置于離心管中靜置1 h進(jìn)行凝固分層，3 000 r/min低溫離心取上清，再12 000 r/min低溫離心10 min，取上清分裝到1.5 mL離心管中，每管0.2 mL，-80 ℃凍存，用于血液代謝組檢測。

1.3 血液代謝組檢測

取50 μL樣品放入1.5 mL離心管中，加入200 μL甲醇作為萃取液，10 μL 2-氯-L-苯丙氨酸(0.5 mg/mL dH2O儲備液)作為內(nèi)標(biāo)，渦旋混合30 s，在-20 ℃下靜置10 min，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，將180 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管中。從每個樣品中取20 μL與標(biāo)準(zhǔn)品合并，在真空濃縮器中完全干燥，加入30 μL甲氧基胺鹽酸鹽于80℃溫育30分鐘，向樣品等分試樣中加入40 mol N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA試劑)，1%三甲基氯硅烷(TMCS)，在70 ℃下孵育1.5 h。當(dāng)冷卻至室溫時，將5μL FAME Standard Mixture(在氯仿中)添加到質(zhì)控樣品中，通過氣相色譜系統(tǒng)與Pegasus HT飛行時間質(zhì)譜儀(GC-TOF-MS)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、對齊，導(dǎo)出包含樣本信息、保留時間、質(zhì)荷比、信號強度等信息的收集。將質(zhì)荷比排序，查找內(nèi)標(biāo)物，將保留時間進(jìn)行排序，計算內(nèi)標(biāo)歸一化。歸一化處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行模式識別和多變量統(tǒng)計分析。正交化偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)發(fā)現(xiàn)兩組間差異代謝產(chǎn)物，選取標(biāo)準(zhǔn)為變量投影重要度(Variable Importance for theProjection, VIP)>1且其積分值t-test檢驗(P值)<0.05。

2 結(jié)果

2.1 湖羊血液代謝產(chǎn)物圖譜

湖羊血清GC-TOF-MS總離子流色譜見圖1。麥秸組和苜蓿組的血清代謝輪廓出峰性狀和出峰數(shù)量無特別明顯差別，進(jìn)一步鑒定出743個質(zhì)譜峰，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后共有578個有效峰能被保留。通過LECO-Fiehn Rtx5代謝物數(shù)據(jù)庫檢索，最終定性為386種代謝產(chǎn)物。386種代謝物中，包括198種氨基酸類，87種糖類，45種脂肪類，33種有機酸，其他均為一些生物堿、維生素、堿基衍生物等。

圖1 湖羊血清GC-TOF-MS苜蓿(X)和麥秸組(M)離子流圖

2.2 飼喂麥秸第7天對湖羊血液代謝物的影響

試驗開始前，兩組間血液代謝物無顯著差異。試驗第7天時，麥秸組和苜蓿組血液代謝譜差異顯著(圖2)。飼喂麥秸顯著影響了7種血液代謝物的含量，其中樅酸、丙氨酸、聯(lián)苯、丙二酸和尿素含量顯著增加，果糖2,6-二磷酸酯降解產(chǎn)物和β-丙氨酸含量顯著降低(表2)。樅酸、丙氨酸、聯(lián)苯、丙二酸和尿素上調(diào)的倍數(shù)分別為6.091、6.833、4.481和1.791；果糖2,6-二磷酸酯降解產(chǎn)物和β-丙氨酸呈現(xiàn)下降趨勢。

注：橫坐標(biāo)表示組間差異程度，縱坐標(biāo)表示組內(nèi)差異程度。下同

圖2 PLS-DA分析飼喂麥秸第7天對湖羊血液代謝物的影響

2.3 飼喂麥秸第14天對湖羊血液代謝物的影響

試驗第14天時，麥秸組和苜蓿組血液代謝產(chǎn)物譜差異顯著(圖3)，飼喂麥秸顯著增加了1-甘油-棕櫚酸酯、聯(lián)苯、葵酸和胱氨酸含量(表3)。其中1-甘油-棕櫚酸酯上調(diào)了1.821倍，聯(lián)苯上調(diào)了1.791倍，葵酸上調(diào)了1.352倍，胱氨酸上調(diào)了4.371倍。麥秸組沒有顯著降低的血液代謝產(chǎn)物。

表2 飼喂麥秸第7天時湖羊血液差異代謝物

代謝物質(zhì)VIPPFCLog2FC樅酸1.830.0046.0912.608丙氨酸1.900.0026.8332.772β-丙氨酸2.100.0000.202-2.321聯(lián)苯2.370.0004.4812.164果糖2,6-二磷酸酯降解產(chǎn)物2.180.0000.001-9.965丙二酸1.910.0021.7910.252尿素1.900.0070.303-1.722

注：FC結(jié)果是麥秸組/苜蓿組的值

Log2(FC)值小于0則表示麥秸組血液差異代謝物質(zhì)含量低于苜蓿組

圖3 PLS-DA分析飼喂麥秸第14天對湖羊血液代謝物的影響

表3 飼喂麥秸第14天時湖羊血液差異代謝物

代謝產(chǎn)物VIPPFCLog2(FC)1-甘油-棕櫚酸酯1.580.0211.8210.864聯(lián)苯1.910.0011.7910.853葵酸1.490.0411.3520.435胱氨酸1.900.0014.3712.127

注：FC結(jié)果是麥秸組/苜蓿組的值

Log2(FC)值小于0則表示麥秸組血液差異代謝物質(zhì)含量低于苜蓿組

2.3 飼喂麥秸第21天對湖羊血液代謝物的影響

試驗第21天時，麥秸組和苜蓿組血液代謝產(chǎn)物譜無顯著差異(圖4)。發(fā)現(xiàn)了386種代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物大多數(shù)為氨基酸類。

圖4 PLS-DA分析飼喂麥秸第21天對湖羊血液代謝物的影響

3 討論

血液系統(tǒng)作為機體內(nèi)部的運輸系統(tǒng)，能將從消化道上皮細(xì)胞吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)綑C體的各個組織器官以及細(xì)胞中，同時又能將機體內(nèi)無法利用的代謝廢物運送到體外，避免機體堆積代謝廢物和毒性物質(zhì)[7]。血液系統(tǒng)通過分泌和釋放信號分子來調(diào)控機體內(nèi)各種不同的生理功能。由于血液可以感知機體內(nèi)小分子物質(zhì)含量的微小波動，所以血液代謝的結(jié)果對試驗有很大的參考價值[8]。本試驗中飼喂麥秸和苜蓿的湖羊血液代謝差異物質(zhì)主要有樅酸、丙氨酸、丙二酸、尿素、果糖2,6-二磷酸酯降解產(chǎn)物、β-丙氨酸、1-甘油-棕櫚酸酯、聯(lián)苯、葵酸和胱氨酸。武雪會[7]的研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛血液中的差異代謝差異物質(zhì)主要有天冬酰胺、異亮氨酸、3-羥基丁酸、絲氨酸、水楊苷、壬酸、辛二酸等，與本試驗結(jié)果不同，這可能與動物類別有關(guān)。馬守慶[8]的研究發(fā)現(xiàn)，豬血液中的代謝產(chǎn)物主要有3-羥基丁酸、丙酮酸、丙氨酸、苯丙氨酸和一些脂類及有機酸類，和本試驗中檢測到的大部分血液代謝差異物質(zhì)相同。

飼喂麥秸升高了丙氨酸、丙二酸、1-甘油-棕櫚酸酯，葵酸和胱氨酸含量，可能是麥秸中纖維素含量較高，導(dǎo)致湖羊胃腸道微生物菌群發(fā)生變化，從胃腸道上皮吸收入血的微生物發(fā)酵產(chǎn)物也發(fā)生了改變，所以相應(yīng)改變了經(jīng)血液運輸?shù)礁鱾€器官組織的代謝產(chǎn)物。丙氨酸對于反芻動物是一種重要的生糖氨基酸，可以作為碳骨架載體來合成葡萄糖。在肌肉和其它降解氨基酸的組織中，氨基基團(tuán)通過轉(zhuǎn)氨基作用以谷氨酰胺的形式儲存起來，隨后谷氨酰胺將氨基基團(tuán)通過丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移給丙酮酸，形成丙氨酸和 α-酮戊二酸，丙氨酸進(jìn)入血液繼而運入肝臟并在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用下催化與上述反應(yīng)相反的過程，生成丙酮酸并用于糖異生作用，形成葡萄糖并被循環(huán)系統(tǒng)運回各組織器官中。丙氨酸在與谷氨酰胺共同作用時，在生物體內(nèi)具有明顯的免疫和升糖作用，同時丙氨酸是血液中氮的運輸工具，在一定程度上增加氮的利用率[9]。本試驗中，飼喂麥秸顯著增加了丙氨酸的含量，并且上調(diào)倍數(shù)較高，這提示我們飼喂麥秸可能是改變了動物消化道中的腸道菌群結(jié)構(gòu)，使微生物發(fā)酵產(chǎn)生的小分子物質(zhì)發(fā)生改變，并且從另一方面證實了飼喂麥秸增強了湖羊體內(nèi)的升糖作用。還有研究顯示，添加外源性的丙氨酸，可能使腸道內(nèi)丙氨酸濃度增加，從而擾亂了大腸桿菌、克雷伯菌產(chǎn)氣菌和賈第蟲細(xì)胞內(nèi)外的丙氨酸濃度差，進(jìn)而影響了生長代謝，這對預(yù)防腹瀉有一定的積極作用，且對斷奶后仔豬的腹瀉也有一定的改善[10]?？峥梢源龠M(jìn)一種糖酵解酶例如α烯醇化酶(ENO1)的產(chǎn)生，而ENO1在卵泡顆粒細(xì)胞(FGC)中起纖溶酶原受體的作用，多項研究表明FGC可以支持濾泡發(fā)育，因此可以說葵酸有助于動物卵泡細(xì)胞的發(fā)育[11]。謝明[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，胱氨酸是蛋氨酸代謝轉(zhuǎn)硫途徑中重要的代謝產(chǎn)物，其與半胱氨酸之間的轉(zhuǎn)化過程為可逆的，從而間接參與谷胱甘肽、牛磺酸等含硫活性物質(zhì)的合成，并且胱氨酸可以與蛋氨酸以互作關(guān)系增加肉雞體重，蛋氨酸不足時，較高的胱氨酸可以促進(jìn)動物生長。胱氨酸作為一種非必需氨基酸，能促進(jìn)細(xì)胞機能，使肝臟功能旺盛，并能中和毒素增強免疫，飼料中添加一定的胱氨酸有利于動物發(fā)育，增強肝腎機能，增加體提高毛皮質(zhì)量，還可以提高飼料轉(zhuǎn)化率[13-14]。本研究中，飼喂麥秸增強了這些物質(zhì)的代謝，這些增加的代謝產(chǎn)物大多與升糖、飼料轉(zhuǎn)化有關(guān)，所以飼喂麥秸可能增強了湖羊?qū)︼暳系睦寐室约按x率。

第7天時，β-丙氨酸發(fā)生了很大幅度的下降。β-丙氨酸是自然界中存在的唯一種β型氨基酸，不參與蛋白質(zhì)的合成，不僅是尿嘧啶和胞嘧啶的分解代謝產(chǎn)物，還是組成泛酸、輔酶 A 等的成分，與組氨酸等結(jié)合形成肌肽及其衍生物鵝肌肽(存在于動物肌肉中)[15]。對于畜牧動物而言，β-丙氨酸具有多種生理功能：可以作為神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)機體新陳代謝；作為輔酶A和泛酸等活性物質(zhì)的中間合成體；提高動物對飼料的利用率；提高生產(chǎn)性能。本研究中，飼喂麥秸抑制了β-丙氨酸代謝，這可能導(dǎo)致了湖羊生產(chǎn)性能降低。β-丙氨酸可以通過血液循環(huán)到達(dá)各個組織器官，在經(jīng)過肌肽合成酶催化合成功能性肌肽，從而發(fā)揮作用，提高肌肉抗氧化能力[16]。肌肽是一種功能性二肽，可以穩(wěn)定細(xì)胞pH值、抑制脂質(zhì)過氧化、以及清除自由基的功能，有研究發(fā)現(xiàn)，β-丙氨酸可以提高肌肽含量[17]。綜上，飼喂麥秸可能降低了湖羊?qū)︼暳系霓D(zhuǎn)化率。β-丙氨酸可以調(diào)節(jié)畜禽肌肉生長、改善動物產(chǎn)品品質(zhì)[18]，而飼喂麥秸可能抑制了湖羊的這種代謝調(diào)節(jié)。

本研究運用代謝組學(xué)的方法探索了飼喂麥秸對湖羊血液代謝物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂麥秸對湖羊血液代謝物產(chǎn)生了顯著影響。飼喂7 d時影響最大，隨著時間的變化，影響逐減少，21 d時影響消失。楊艷玲[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，日糧精粗比能顯著改變瘤胃內(nèi)環(huán)境和血清中的代謝物質(zhì),在長期飼喂麥秸型粗飼料條件下，奶牛逐漸對高精料產(chǎn)生了耐受性，獲得了較為穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境和血液代謝物水平。而本試驗中，飼喂麥秸使湖羊血液差異代謝物在0-21 d過程中有個動態(tài)變化過程，這可能是由于在飼喂初期，日糧類型對湖羊消化道內(nèi)環(huán)境影響較大，而在長期飼喂下，湖羊機體對麥秸產(chǎn)生了適應(yīng)性，從而使機體內(nèi)各項指標(biāo)維持相對穩(wěn)定。本研究還發(fā)現(xiàn)，飼喂麥秸顯著影響的代謝物大多與飼料轉(zhuǎn)化率和糖代謝有關(guān)，但其中具體機制還有待進(jìn)一步探索。本研究為麥秸在反芻動物上的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。