童金鳳，張佳秀，江政松，孫午，劉曉峰

(九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

肺癌是一種嚴(yán)重影響人類身體健康的呼吸道惡性腫瘤，五年生存率僅17%[1]。肺癌分為兩類：小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。前者約占15%，后者約占85%，包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。吸煙和環(huán)境中的致癌物是肺癌的致病因素。CD8+T細(xì)胞也稱細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CTLs或Tc細(xì)胞，可以分化為Tc2，Tc9，Tc17和調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞[2]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)[3]。有研究表明[4]，Tc9細(xì)胞在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，我們通過(guò)研究肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的Tc9細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-9、主要細(xì)胞因子IL-9mRNA，以明確肺癌患者Tc9細(xì)胞的抗腫瘤作用，為下一步干預(yù)治療和細(xì)胞治療提供依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月—2019年6月收治的肺癌患者40 例，其中小細(xì)胞肺癌(SCLC組)20 例，男10 例，女10 例，年齡(51.65±13.88) 歲；非小細(xì)胞肺癌(NSCLC組)20 例(鱗癌8 例，腺癌12 例)，男10 例，女10 例，年齡(53.50±13.00) 歲。選擇與患者性別、年齡相匹配的健康人20 例為健康對(duì)照組(對(duì)照組)，男10 例，女10 例，年齡(51.90±11.26) 歲。三組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：有病理學(xué)明確診斷的肺癌患者；患者無(wú)其他腫瘤史。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者伴發(fā)自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)病等；患者服用激素類藥物或接受免疫抑制劑的治療。

1.3 方法

1.3.1 試劑及儀器

CD3-FITC和CD8-PEIL-9 PerCP-cy5.5單抗(ebioscience公司)；IL-4，TGF-β1和IL-9 ELISA kit試劑盒(晶美公司)；破膜固定劑(BD公司)；FC500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；ST-360型酶標(biāo)儀(科華生物)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)；QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；DA7600擴(kuò)增儀(達(dá)安基因)。

1.3.2 標(biāo)本采集及處理

所有受檢者均空腹抽取靜脈血3 管，1 管EDTA抗凝用于流式細(xì)胞分析，另1 管EDTA抗凝用于IL-9mRNA檢測(cè)，第3管分離血清，并分裝至無(wú)核酶、無(wú)蛋白酶的EP管后立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 流式細(xì)胞檢測(cè)Tc9細(xì)胞

采取血液制備單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，隨后加入RPMI 1640培養(yǎng)基，采用佛波酯(PMA)和離子霉素在5%CO2濃度37 ℃刺激4 h后，加阻斷劑Brefedlin A(BFA)或莫能霉素2 h以阻斷高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，使產(chǎn)生的細(xì)胞因子聚集于胞內(nèi)，測(cè)定管加入抗人CD3-PE-cy5、抗人CD8-FTIC各5 μL，充分混勻，室溫下置暗處20 min。加磷酸鹽緩沖液1 mL震蕩搖勻，離心5 min，傾去上清，洗滌3 次，加入150 μL破膜固定劑避光孵育40 min，離心取上清，洗滌加入抗人IL-9 PE單克隆抗體室溫避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3 次備用。同時(shí)用FITC，PE和PE-cy5標(biāo)記的抗人IgG抗體設(shè)置同型對(duì)照，用貝克曼庫(kù)爾特FC500流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析使用WinMDI2.9軟件。

1.3.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肺癌患者血清細(xì)胞因子

將冰凍血清室溫解凍，使用ELISA kit試劑盒測(cè)定IL-4，TGF-β1和IL-9濃度，所有操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書。

1.3.5 RNA提取及PCR儀檢測(cè)IL-9mRNA

使用TRIzol試劑從PBMC中提取總RNA，采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，利用Quanti Tect SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為F：5′-GTGCCACTGCAGTGCTAATGT-3′，R：5′-CTCTCACTAAGCATGGTCTGG-3′。采用2-△△Ct方法計(jì)算IL-9 mRNA水平。在DA7600上采用如下設(shè)置反轉(zhuǎn)錄PCR：95 ℃下初始變性30 s，58 ℃下退火15 s，72℃下延伸15 s。然后在95 ℃ 5 s下35 個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 三組IL-4和TGF-β1比較

SCLC組和NSCLC組的IL-4和TGF-β1顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為105.6和4.86，P<0.05)；SCLC組和NSCLC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 三組IL-4和TGF-β1比較

2.2 三組Tc9細(xì)胞和IL-9及IL-9mRNA比

采用CD3/CD8設(shè)門，確定CD3+CD8+細(xì)胞，進(jìn)一步分析CD3+CD8+細(xì)胞，CD3+CD8+IL-9+為Tc9細(xì)胞。與對(duì)照組比較，SCLC組和NSCLC組Tc9比例、IL-9及IL-9mRNA水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SCLC組與NSCLC組此三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為84.91，22.19和29.71，P>0.05)(見表2)。

表2 三組Tc9和IL-9及IL-9mRNA水平比較

2.3 SCLC組和NSCLC組患者Tc9細(xì)胞與IL-9和IL-9mRNA的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，SCLC組和NSCLC組患者Tc9細(xì)胞與IL-9呈顯著正相關(guān)(r=0.882 7，P<0.0001)，Tc9細(xì)胞與IL-9mRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.834 6，P<0.001)(見圖1、圖2)。

圖1 Tc9細(xì)胞與IL-9的相關(guān)性分析

圖2 Tc9細(xì)胞與IL-9mRNA的相關(guān)性分析

3 討 論

細(xì)胞免疫是機(jī)體抗擊腫瘤的主要方式，CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞，可識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)類分子-腫瘤抗原肽復(fù)合物，通過(guò)溶細(xì)胞作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子如γ-干擾素(INF-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)間接殺傷腫瘤細(xì)胞。CD8+原始T細(xì)胞在TGF-β誘導(dǎo)下向調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞分化，IL-4誘導(dǎo)其向Tc2細(xì)胞分化，在TGF-β和IL-6共同作用下分化為Tc17細(xì)胞，Tc9細(xì)胞的發(fā)育、分化則由TGF-β和IL-4誘導(dǎo)[5]。本研究中TGF-β1在肺癌中增高，這與相關(guān)研究結(jié)果相同[6]。IL-4水平在肺癌中增高，IL-4作為一種炎癥因子，可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中15羥基前列腺素脫氫酶表達(dá)[7]。有研究表明[8-9]Tc9細(xì)胞在過(guò)敏性皮炎、抗腫瘤方面有著重要作用。盡管如此，Tc9細(xì)胞在肺癌中的作用卻鮮有研究。

Tc1細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ和細(xì)胞毒因子如GrzB和穿膜蛋白殺死腫瘤細(xì)胞，而分泌IL-9的Tc9細(xì)胞比Tc1細(xì)胞起更重要作用[8]。本研究結(jié)果顯示，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Tc9細(xì)胞均顯著更高，這表明Tc9細(xì)胞參與到了肺癌的病理變化中。除此之外，肺癌患者外周血PBMC中IL-9mRNA和血清IL-9均顯著增高，IL-9是一種受體屬γ鏈家族的細(xì)胞因子，具有直接和間接作用的多重免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，最近因產(chǎn)IL-9的Th9細(xì)胞而重新引起人們的注意[10]。IL-9可來(lái)源于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg、輔助性T細(xì)胞Th2、輔助性T細(xì)胞Th17、輔助性T細(xì)胞Th9等多種細(xì)胞[11]。有研究表明，Tc9細(xì)胞分泌的IL-9較IFN-γ在抗腫瘤方面有更重要作用[4]，IL-9可抑制小鼠鱗癌的生長(zhǎng)[12]，亦可促進(jìn)CTL細(xì)胞抗原的啟動(dòng)并進(jìn)入肺癌組織發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。本研究顯示顯著增高的IL-9及其mRNA和Tc9細(xì)胞相關(guān)，Tc9細(xì)胞和IL-9可能相互作用發(fā)揮了抗擊肺癌的過(guò)程。

綜上所述，Tc9細(xì)胞參與了肺癌的病理變化，而這種變化可能是通過(guò)分泌細(xì)胞因子IL-9實(shí)現(xiàn)的。