梁嘉樂，彭偉康，陳詩曼，羅 芬，張志珍，馬衛(wèi)列，丁 航*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 東莞 523808)

兒茶，又名烏爹泥、烏壘泥、烏丁泥，為豆科植物兒茶的枝干或茜草科植物兒茶鉤藤的枝葉煎汁濃縮而成的干燥浸膏。兒茶在我國應(yīng)用廣泛，早在明朝，《本草述》便對其有詳細記載； 現(xiàn)代臨床應(yīng)用于小兒消化不良、腹瀉、外用治療潰瘍、濕疹等 癥。兒茶素為兒茶的主要有效成分，近年來已有的研究表明， 兒茶素類物質(zhì)有抗癌、抗心律失常、調(diào)血脂、抗病毒等活性[1]。課題組前期已對兒茶的水溶性物質(zhì)進行了提取，并在細胞水平觀察了最大無毒濃度范圍，本實驗在此基礎(chǔ)上，進一步研究兒茶水提物的體外抗甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的作用，以期為開發(fā)出高效安全、副作用小的抗流感病毒新藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(NUAIRE公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；細菌培養(yǎng)搖床(上海和程儀器制造有限公司)；多功能酶標儀(基因有限公司)；熒光分光光度儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.2 材料

中藥兒茶浸膏購自東莞國藥；犬腎(MDCK)細胞、293T細胞、pcDNA3.1質(zhì)粒、甲型流感病毒反向遺傳8質(zhì)粒病毒系統(tǒng)、pHH-Gluc質(zhì)粒由本室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM2000)購自Invitrogen公司；熒光素酶活性測定底物購自Promega公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo公司。其他的是國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

MDCK細胞和293T細胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，兩天或三天傳代一次。傳代時吸出舊培養(yǎng)基，用0.25%胰酶溶液(含乙二胺四乙酸)消化細胞，鏡下觀察細胞分散變圓，快速將胰酶溶液吸出，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，用槍輕輕吹打細胞懸液后取適當體積的種回培養(yǎng)瓶中，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，復(fù)蘇傳約3代后即可用于實驗。

1.2.2 兒茶水性物質(zhì)的提取

在500 mL超純水中加入25 g已粉碎的中藥材兒茶浸膏，60℃水浴浸泡24 h，然后回流提取兩次(料液比：1∶20，提取溫度：90℃，提取時間：2 h)，藥液經(jīng)濃縮、水提醇沉、過濾、除菌后保存于-20℃。提取方法見參考文獻[2]。

1.2.3 甲型流感病毒(IAV)的制備

293T細胞和MDCK細胞(2:1)混養(yǎng)，接種于6孔板；培養(yǎng)24 h后，采用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染IAV反向遺傳8質(zhì)粒系統(tǒng)，按照使用說明書進行轉(zhuǎn)染。IAV制備及病毒TCID50值測定參考文獻[2-3]。

1.2.4 CCK-8測定兒茶水提物對IAV增殖的抑制

MDCK細胞接種96孔板(3000個細胞/孔)，培養(yǎng)24 h后將各孔中的液體吸出，用空白培養(yǎng)基洗1次后進行實驗。實驗分3組，水提物處理組、IAV對照組和細胞對照組。水提物處理組和IAV對照組每孔加入0.1 mL的病毒稀釋液(病毒用量為100 TCID50)吸附3 h后，吸出病毒液，用空白培養(yǎng)基洗1次；水提物處理組每孔加入0.1 mL不同濃度的兒茶水提物，設(shè)2、4、6、8、10、12、14 g/L濃度梯度，每個濃度設(shè)3個平行孔；同時IAV對照組每孔加入0.1 mL細胞維持培養(yǎng)基；細胞對照組加0.1 mL細胞維持培養(yǎng)基，都設(shè)3個平行孔。細胞培養(yǎng)36 h后，分別吸出各組的培養(yǎng)基，用空白培養(yǎng)基洗1次，加含10% CCK-8試劑的空白培養(yǎng)基0.1 mL，于培養(yǎng)箱孵育2 h后測定OD值。根據(jù)各組平均吸光度值計算兒茶水提取對IAV抑制率。

1.2.5 熒光素酶活性分析兒茶水提物抗IAV的感染

將2 mL的MDCK細胞接種6孔板，37℃培養(yǎng)24 h，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pHH-Gluc質(zhì)粒，以pcDNA3.1質(zhì)粒作為對照。轉(zhuǎn)染24 h后，消化細胞接種于96孔板中，3000細胞/孔，培養(yǎng)24 h后進行實驗。實驗分3組，水提物處理組、IAV對照組和細胞對照組。水提物處理組和IAV對照組每孔加入0.1 mL的病毒稀釋液(病毒用量為100 TCID50)吸附3 h后，吸出病毒液；水提物處理組每孔加入0.1 mL不同濃度的兒茶水提物，設(shè)4、6、8、12 g/L四個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個平行孔；同時IAV對照組每孔加入0.1 mL細胞維持培養(yǎng)基；細胞對照組加0.1 mL細胞維持培養(yǎng)基，設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)36 h后從每孔吸取40 μL上清液，加入1 μL熒光素酶底物混勻，放入機器中檢測，讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)各組的平均值，計算熒光素酶的相對強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析由 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件完成，實驗結(jié)果均采用表示，實驗重復(fù)3次，以P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒茶水提物對IAV增殖的抑制作用

CCK-8法測定結(jié)果見表1。IAV對照組抑制率為(32.46±2.19)%，兒茶水提取濃度在6～12 g/L時對IAV增殖的抑制率均在80%以上，與IAV對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2、4、14 g/L時對IAV增殖的抑制率與IAV對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述實驗結(jié)果表明，兒茶水提物在2～14 g/L范圍內(nèi)時，能夠顯著抑制IAV的增殖，即具有抗IAV活性。

表1 不同濃度兒茶水提物對IAV增殖的抑制作用

2.2 兒茶水提物對IAV感染性的影響

實驗結(jié)果表明，與IAV對照組相比，不同濃度處理組細胞的相對熒光強度均降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見表2。提示兒茶水提取具有抗IAV感染性的作用。

表2 不同濃度兒茶水提物對IAV感染細胞熒光素酶活性的影響

3 討論

甲型流感病毒廣泛存在于自然界，除感染人外，流感病毒在動物 體內(nèi)也廣泛存在，常常能引起人和動物的流感大流行，甚至出現(xiàn)死亡[4]。此外，甲型流感病毒表面抗原極易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒出現(xiàn)新的亞型，而人體往往無法產(chǎn)生抵御新生病毒的抗體，從而造成流感的全球性大爆發(fā)，所以甲型流感病毒是危害程度最高的一種流感病毒[4]。而目前臨床使用的抗流感病毒藥物對宿主細胞存在毒副作用及耐藥性等缺陷[5]。因此，發(fā)展新型療效好副作用少的抗流感病毒藥物對于流感的防治十分重要。

我們前期已在MDCK細胞上觀察了兒茶水提物的致細胞病變(CPE)，分析兒茶水提物的細胞毒性，確定兒茶水提物在1.00～15.00 g/L濃度內(nèi)，對MDCK細胞有一定的安全性。本實驗是在這個濃度范圍內(nèi)，通過CCK-8法和細胞熒光素酶活性檢測法進一步探究提取物的抗IAV活性。CCK-8法的實驗結(jié)果表明，兒茶水提物能夠顯著抑制IAV的增殖。而細胞熒光素酶活性檢測法是用Gluc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細胞，然后吸附流感病毒，利用流感病毒的RNA聚合酶啟動Gluc基因表達熒光素酶，通過檢測熒光素酶活性間接測試兒茶水提物能否抑制流感病毒，如果藥物組檢測到的熒光素酶活性相比于陽性對照組降低，則說明藥物抑制了病毒，如果檢測到的熒光素酶活性與陽性對照組沒有差別，則說明藥物不能抑制病毒。本實驗細胞熒光素酶活性檢測法的結(jié)果是不同濃度水提物處理組細胞的相對熒光強度均顯著降低，提示兒茶水提物具有很好的抗IAV感染性的作用。但是，實驗中所用的是兒茶水溶性粗提物，下一步還需進行分離、純化及鑒定，以獲得明確的活性單體，來進一步研究其抗甲型流感病毒的活性及作用機制。