禹亞男，李 婷

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 醫(yī)學(xué)重癥監(jiān)護(hù)科，重慶 400000)

嗜熱酶是從嗜熱微生物中分離得到的一類熱穩(wěn)定性酶，具有化學(xué)催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，尤其是在高溫條件下保持的極好穩(wěn)定性，克服了常溫酶在應(yīng)用中出現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，使很多高溫化學(xué)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，從而將極大的促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。葡聚糖酶(glucanase)能專一性催化葡聚糖或地衣多糖中臨近β-1,3鍵、β-1,4鍵水解，產(chǎn)生3- 5個(gè)葡萄糖單位的低聚糖及葡萄糖，從而降低葡聚糖的親水性和粘性[1]，因此現(xiàn)被很多國(guó)家用來(lái)作為飼料添加劑[2]及啤酒生產(chǎn)的酶制劑[3]。對(duì)于來(lái)自不同物種的糖苷水解，其葡聚糖酶的氨基酸組成和的活性部位存在差異。例如，姜彤等研究來(lái)源于柄孢霉的β-葡聚糖酶晶體屬于GH131糖苷酶家族，由外圍的9個(gè)β折疊和內(nèi)部的6個(gè)β折疊構(gòu)成具有典型的β-jelly-roll結(jié)構(gòu)，表面呈凹槽結(jié)構(gòu)，易于和底物結(jié)合。其中E99和E139作為酸堿供體，是保守的催化結(jié)合位點(diǎn)[4]。來(lái)源于嗜熱擬青霉的Ptlic16A晶體屬于糖苷水解酶GH16家族，其催化結(jié)構(gòu)為β-jelly-roll，其中E113作為親核劑，E118作為質(zhì)子供體，W97、W101、W253和底物的識(shí)別有關(guān)[5]。來(lái)源于黃孢原毛平革菌的Lam55A葡聚糖酶屬于GH55家族，其具有兩個(gè)平行的右手β折疊結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的一個(gè)類似于胸腔的結(jié)構(gòu)，其催化位點(diǎn)位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間[6]。植物葡聚糖酶主要屬于GH17家族，其結(jié)構(gòu)具有典型的TIM桶結(jié)構(gòu)(TIM-barrel fold)，其酸堿催化、親核體分別位于第4和第7 β折疊鏈上[7]。來(lái)源于GH64家族的LPHase葡聚糖酶晶體其催化部位由一個(gè)β折疊和一個(gè)α/β結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成了寬廣的溝槽[8]。目前尚沒(méi)有關(guān)于來(lái)源嗜熱地衣芽孢桿菌葡聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。有研究表明，葡聚糖酶的最適溫度為55℃，在溫度100℃下，30 min仍有70%的生物活性并且可以催化多種糖苷鍵水解[9]，是一種新型的葡聚糖酶。本研究在此研究的基礎(chǔ)之上，通過(guò)利用分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)研究葡聚糖酶與二聚糖UNK之間分子的識(shí)別機(jī)制，以期為嗜熱地衣芽孢桿菌葡聚糖酶分子結(jié)構(gòu)后續(xù)的理性改造和高效利用提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葡聚糖酶結(jié)構(gòu)的制備

利用在線服務(wù)器I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)對(duì)嗜熱地衣芽孢桿菌葡聚糖酶(登錄號(hào)：Y_006712752.1)進(jìn)行同源建模獲的試驗(yàn)?zāi)０澹ㄟ^(guò)GROMACS4.6.5軟件[10]對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲得最佳的構(gòu)象。

1.2 配體分子的制備

利用ChemOffice 3D軟件[11]構(gòu)建二聚糖分子結(jié)構(gòu)，用ChemOffice 3D的MM2模板對(duì)底物進(jìn)行能量最小化，保存結(jié)構(gòu)為pdbqt格式，以便進(jìn)行進(jìn)一步的對(duì)接工作。

1.3 分子對(duì)接

采用AutoDock4.2程序包[12]對(duì)二聚糖和葡聚糖酶進(jìn)行預(yù)處理。對(duì)接時(shí)，在格點(diǎn)盒子中，X維、y維、z維格點(diǎn)數(shù)目分別設(shè)為52、54、54.該格點(diǎn)盒子的中心坐標(biāo)為-24.855，14.414，93.059，格點(diǎn)間距為0.0392 nm。采用拉馬克遺傳算法(LGA)來(lái)尋找配體和受體最佳的結(jié)合位置，將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合，以半經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)為打分函數(shù)，對(duì)小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索。為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，采用遺傳算法中較大的運(yùn)算參數(shù)，種群個(gè)數(shù)設(shè)為150，能量評(píng)估的最大數(shù)目設(shè)為1×107，運(yùn)算循環(huán)數(shù)設(shè)為1000，其他的使用該程序默認(rèn)的參數(shù)。同時(shí)設(shè)立2組平行組。最后依據(jù)獲得的1000個(gè)配體小分子構(gòu)象進(jìn)行聚類分析(參數(shù)為0.2 nm)，根據(jù)聚類的情況、結(jié)合能以及構(gòu)象的合理性選取最佳構(gòu)象進(jìn)行分析并作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始構(gòu)象，同時(shí)使用acpype程序[13]生成小分子配體的拓?fù)湮募糜跇?gòu)建分子動(dòng)力學(xué)模擬中的復(fù)合物拓?fù)湮募?/p>

1.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

本實(shí)驗(yàn)采用gromacs4.6.5軟件，使用gromacs43 al力場(chǎng)[14]，水分子采用SPCE模型[15]，遠(yuǎn)程靜電作用采用PME方法[16]，系統(tǒng)的溫度和壓力通過(guò)V-rescale和Parrinel-Rahman實(shí)現(xiàn)控制[17]。將復(fù)合物置于一個(gè)立方體水盒子中，使用周期性邊界條件以消除邊界效應(yīng)，加入離子中和電荷使整個(gè)體系處于中性環(huán)境，使用5000步最陡下降法進(jìn)行能量最小化，然后進(jìn)行400 ps的限制性動(dòng)力學(xué)模擬，使得溫度分別達(dá)到300 K，壓力為1個(gè)大氣壓，溫度和壓力耦合系數(shù)為0.2 ps[18]，待體系平衡后，進(jìn)行50 ns的自由動(dòng)力學(xué)模擬，模擬中采用的積分步長(zhǎng)為2 ps，每2 ps保存一次軌跡結(jié)構(gòu)用于后期數(shù)據(jù)的處理。通過(guò)分析復(fù)合物root mean squared deviation (rmsd)值，系統(tǒng)能量來(lái)判斷復(fù)合物構(gòu)象的穩(wěn)定性。

1.4.1 底物和酶之間接觸數(shù)和接觸距離的計(jì)算

底物和葡聚糖酶之間的接觸數(shù)和接觸距離均采用GROMACS自帶程序g_mindist進(jìn)行計(jì)算，其中計(jì)算接觸數(shù)時(shí)所用的截?cái)嗑嚯x為0.6 nm[19]。

1.4.2 復(fù)合物自由能計(jì)算

采用單軌跡方案的MM-PBSA方法計(jì)算葡聚糖酶與底物小分子的結(jié)合自由能，此方法是從復(fù)合物的MD模擬平衡的后5 ns軌跡中每隔一定的時(shí)間間隔取出體系結(jié)構(gòu)，通過(guò)下式計(jì)算出平均結(jié)合自由能。

△Gbind=△Emm+△Gsol-T△S

其中△Gbind是結(jié)合自由能，△Emm、△Gsol和T△S分別是氣相中的分子力學(xué)能、溶劑自由能和熵變對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)。

△Emm=△Eele+△Evdw

式中△Eele和△Evdw分別表示氣相中靜電相互作用和范德華能。溶劑自由能也由如下的兩部分組成：

△Gsol=△Gel+△Gnonel

式中△Gel和△Gnonel分別代表極性溶劑自由能和非極性溶劑自由能。前者的成分可以通過(guò)求解泊松—波爾茲曼方程獲得[20]，溶質(zhì)和溶劑的介電常數(shù)分別設(shè)為1.0和80.0。后一項(xiàng)由下列的經(jīng)驗(yàn)方程求解：△Gnonel=γSASA+β

式中△Gnonel代表非極性溶劑自由能，SASA代表溶劑可及接觸面積，γ和β的值分別取為2.27 kJ/(mol·nm2)和3.85 kJ/mol。至于熵效應(yīng)，可用簡(jiǎn)正模分析來(lái)計(jì)算，此項(xiàng)的計(jì)算非常耗時(shí)且對(duì)結(jié)果影響較小，因此一般情況下，可忽略熵變效應(yīng)[21]。

1.4.3 氫鍵分析

本文中小分子配體和葡聚糖酶之間的氫鍵利用GROMACS自帶程序g_hbond進(jìn)行分析。當(dāng)供體原子D和受體原子A之間的距離小于0.35 nm，且D-H-A之間的夾角大于120°時(shí)，即認(rèn)為供體原子D和受體原子A之間形成氫鍵。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對(duì)接

圖1 復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)和平面圖

通過(guò)利用分子對(duì)接方法，對(duì)二聚糖小分子配體與葡聚糖酶進(jìn)行對(duì)接，選取自由能結(jié)合最小的構(gòu)象，其試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖1a中，我們可以看出，Thr126、Thr124、Asp71、Ala72、His73、Gly46和Lys47殘基參與二聚糖小分子的結(jié)合，并且其結(jié)合部位與Cheng等人研究的來(lái)自嗜熱擬青霉的Ptlic16A晶體結(jié)合部位一致[5]。通過(guò)使用LigPlot軟件[22]，獲得復(fù)合物結(jié)合部位平面圖1b，從圖中，我們可以看出，Ala72、Gly46和Gly125殘基分別與小分子配體形成疏水相互作用，Thr124、Lys47、His73、Asp71和Lys126殘基分別參與復(fù)合物氫鍵的形成。

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

2.2.1 均方根偏差分析

從圖2中，我們可以看出，葡聚糖酶和二聚糖分子結(jié)構(gòu)從5 ns后趨于平衡，其中分別圍繞著0.3 nm和0.15 nm值上下波動(dòng)，在45～50 ns的時(shí)間內(nèi)，二聚糖小分子結(jié)構(gòu)的rmsd波動(dòng)較小，并且系統(tǒng)總能量的平均波動(dòng)量低于0.8%，因此可以認(rèn)為系統(tǒng)在MD模擬后比較穩(wěn)定，用此軌跡分析得出的結(jié)果是可靠的。

圖2 酶和底物的RMSD值的變化

2.2.2 二聚糖和葡聚糖酶之間的接觸數(shù)和分子間的距離

從圖3A中我們可以看出，小分子配體與蛋白質(zhì)之間的接觸數(shù)在前10 ns內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，其接觸數(shù)目增多，在30～50 ns內(nèi)，其值趨于平衡，總體波動(dòng)范圍為700～950，并且在794附件集中；圖3B中為蛋白質(zhì)與小分子之間的接觸距離的頻率分布，從圖中我們可以看出，其值分布在0.1～0.3 nm之間，并且集中于0.22 nm，因此我們可以認(rèn)為葡聚糖酶與二聚糖分子的結(jié)合較為緊密。

圖3 A酶與底物的接觸數(shù)，B酶與底物之間的距離

2.2.3 復(fù)合物結(jié)合自由能

通過(guò)上文對(duì)系統(tǒng)中RMSD的分析，我們選取了45～50 ns時(shí)間內(nèi)的軌跡作為研究對(duì)象，每隔100 ps提取構(gòu)象，共獲得51個(gè)構(gòu)象，通過(guò)利用MM-PBSA方法計(jì)算結(jié)合自由能，其結(jié)果如表1所示，從表1我們可以看出，小分子UNK與葡聚糖酶的結(jié)合自由能為-54.718 kJ/mol，這個(gè)結(jié)果表明小分子UNK與葡聚糖酶產(chǎn)生了比較強(qiáng)的結(jié)合能力。范德華作用能(△Evdw)為-88.473 kJ/mol，該結(jié)果表明范德華作用可以有效的促進(jìn)小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合。靜電相互作用能(△Eele)和非極性溶劑自由能(△Gnonel)分別為-7.919 kJ/mol和-8.164 kJ/mol，這表明該作用為小分子的結(jié)合提供了較小的貢獻(xiàn)。極性溶劑自由能(△Gel)為49.838 kJ/mol，這說(shuō)明，該相互作用極大的衰減了靜電相互作用，不利于小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

表1 MM-PBSA計(jì)算所得的能量(kJ/mol)

2.2.4 活性位點(diǎn)氨基酸殘基的貢獻(xiàn)

為了進(jìn)一步研究小分子UNK與葡聚糖酶分子間的相互作用模式，通過(guò)利用MM-PBSA程序計(jì)算每個(gè)氨基酸殘基對(duì)結(jié)合小分子的貢獻(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，Gly46、Leu63、Gln67、Tyr68、His73、Thr124、Gly125和Gln129對(duì)結(jié)合小分子的貢獻(xiàn)較大，其中His73和Lys126殘基可能作為親核劑，為催化部位的活性位點(diǎn)，Gly46、Leu63、Gln67、Tyr68、Thr124、Gly125和Gln129可能與小分子結(jié)合識(shí)別有關(guān)。從表2 我們也可以看出，His73為堿性氨基酸，帶有正電荷，與小分子之前形成的靜電相互作用和范德華作用力較強(qiáng)，結(jié)合能為-4.4088 kJ/mol，Tyr68為疏水性氨基酸，極性溶劑自由能對(duì)靜電作用影響較小，其對(duì)小分子的結(jié)合自由能為-4.6058 kJ/mol，其他氨基酸殘基對(duì)小分子的結(jié)合自由能貢獻(xiàn)均低于-1 kJ/mol。與上文對(duì)接試驗(yàn)結(jié)果較為一致。

圖4 底物與酶結(jié)合的相互作用譜

表2 能量分解的主要貢獻(xiàn)殘基各部分能量值

2.2.5 氫鍵分析

葡聚糖酶與小分子UNK之間形成的氫鍵數(shù)由圖5所示，從圖5可知，氫鍵數(shù)目隨時(shí)間的變化而變化，在0～10 ns內(nèi)，氫鍵數(shù)目呈遞增的趨勢(shì)，最大值為21；在20～40 ns時(shí)間段內(nèi)，其氫鍵數(shù)目處于動(dòng)態(tài)平衡，在3～15范圍內(nèi)波動(dòng)；其整體的平均值為7。通過(guò)利用VMD軟件分析，我們可以得出表3， 從表3我們可以看出His73和Thr124殘基與小分子之間的氫鍵占有率均大于50%，這說(shuō)明這些氨基酸殘基與小分子之間形成的氫鍵較為穩(wěn)定。

圖5 底物與酶之間氫鍵數(shù)隨時(shí)間的變化

表3 主要?dú)埢臍滏I分析

3 結(jié)論

本文利用分子對(duì)接與動(dòng)力學(xué)模擬的方法，研究葡聚糖酶結(jié)合底物的活性位點(diǎn)。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，選取最佳的分子構(gòu)象用于分子動(dòng)力學(xué)模擬，用MM-PBSA方法計(jì)算了小分子UNK和葡聚糖酶之間的結(jié)合能，計(jì)算結(jié)果顯示范德華相互作用、靜電相互作用和非極性溶劑化自由能是形成復(fù)合物的主要驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)對(duì)各個(gè)氨基酸殘基的貢獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Gly46、Leu63、Gln67、Tyr68、His73、Thr124、Gly125和Gln129是對(duì)小分子UNK的結(jié)合起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。通過(guò)進(jìn)一步研究小分子與葡聚糖酶之間的氫鍵數(shù)目及其對(duì)關(guān)鍵氨基酸的氫鍵分析，我們可以得出，小分子UNK與葡聚糖酶的結(jié)合較為緊密，同時(shí)也可以得出，His73和Thr124殘基與小分子所形成的氫鍵較為穩(wěn)定，對(duì)結(jié)合能貢獻(xiàn)較大。