高 翔 肖獻花 劉永軍 鄭 磊 李貴梅 于 華

(邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056000)

卵巢癌是女性惡性腫瘤中較為常見的疾病，發(fā)病率高，死亡率高，易轉(zhuǎn)移侵襲，患者預(yù)后較差。目前細胞減滅術(shù)與放化療在一定程度上可以減輕腫瘤負荷，但不能明顯改善患者的遠期生存情況，歸因于卵巢癌進展過程中具體的分子生物學(xué)作用機制尚未明確[1]。卵巢癌早期篩查的關(guān)鍵分子可能作為新型標(biāo)志物有助于指導(dǎo)治療的臨床效果，提示患者預(yù)后。在卵巢癌中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1)作為潛在的原癌基因被報道，通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進卵巢癌轉(zhuǎn)移[2]。MDC1是參與DNA損傷修復(fù)(是指DNA受到損傷后機體自發(fā)地進行相應(yīng)的修復(fù)機制)的重要分子[3]。目前，MDC1在卵巢癌進展中的作用機制研究較少[4]，本研究基于卵巢癌的臨床病理和基因分子特點，旨在研究卵巢癌進展的目標(biāo)分子MDC1對卵巢癌進展的影響及其作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取我院2015年8月～2016年10月收治的80例卵巢癌患者，全部患者經(jīng)病理確診，年齡54～68歲，平均(56.3±1.2)歲。納入標(biāo)準：①均符合WHO卵巢癌診斷標(biāo)準并分類；②納入研究前未使用激素藥物，或影響檢測結(jié)果的藥物；③接受定期隨訪與評估疾病預(yù)后者；④本次研究經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準：①合并甲狀腺激素異常者；②合并庫欣綜合征及其他內(nèi)分泌疾病者；③其他腫瘤疾病者。

1.1.2細胞及主要試劑 細胞系人卵巢HO8910 PM，購于中國典型培養(yǎng)物保藏細胞庫，經(jīng)轉(zhuǎn)染MDC1干擾載體pGIPZ-shMDC1及空載體pGIPZ-NC-backbone(美國Open Biosystems公司)，命名為shMDC1-HO8910PM、NC(空白對照)-HO8910PM。購于美國Sigma-Aldrich的MDC1小干擾RNA (siR NA)序列為：negative control (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′)，siRNA2 (5′-CUCAUUGCUCCAUUCCACUdTdT-3′)，siRNA3 (5′-GAAGAUCUUCCAUGGAGUAdTdT-3′)；常規(guī)胰酶(上海生工公司)；一抗(美國Gene Tex公司)；二抗(英國Jastesm公司)；MDC1抗體購自美國Sigma公司；染色液購自北京索萊寶生物公司；FBS培養(yǎng)基、碘化丙啶、蘇木素、噻唑蘭(MTT)等試劑購自中國聯(lián)科生物公司。

1.2方法

1.2.1siRNA干擾的轉(zhuǎn)染 控制第2天的對數(shù)生長期細胞密度為30%～50%，若第2天生長良好則進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)移7.5 μl Lipofectamine RNAiMAX和20 μmol/L siRNA液在100 μl的Opti-MEM稀釋后靜置5 min，待混勻后再靜置20 min。使用鋪板細胞PBS洗2次，加入1.8 ml培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染混合物；繼續(xù)孵育4～6 h去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在轉(zhuǎn)染24～72 h后(24 h檢測RNA水平，48 h檢測蛋白水平)，檢測siRNA干擾效率并進行后續(xù)實驗。

1.2.2MTT試驗 選取對數(shù)期細胞，常規(guī)胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪于96孔板，接種密度1 000～3 000個/孔，邊孔用無菌PBS填充；5% CO237℃孵育，至單層細胞鋪滿孔底(細胞貼壁后即可加藥)，加入濃度梯度的藥物。每個孔中添加噻唑蘭(MTT)試劑，繼續(xù)孵育≥4 h。采用空針去除孔內(nèi)液體，避免吸入結(jié)晶沉淀物，注意避光操作，利用檢測儀測定吸光度值。

1.2.3Matrigel侵襲實驗 按照1∶6稀釋Matrigel和無血清培養(yǎng)液，Transwell小室中每孔轉(zhuǎn)移15 μl，37℃靜置1 h。HO8910PM細胞轉(zhuǎn)染24 h后，1 000 r/min離心1 min，去上清，加入無血清培養(yǎng)液及3×105個細胞，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)稀釋至400 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔。將600 μl含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液加入小室，繼續(xù)在CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。去掉嵌室內(nèi)液，PBS洗3次，90%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干后，顯微鏡拍照并計數(shù)。

1.2.4細胞劃痕法實驗 接種以上細胞待鋪滿培養(yǎng)板80%時，轉(zhuǎn)染6 h后換液，直至鋪滿整個培養(yǎng)板，使用200 μl槍頭劃痕，用PBS沖洗5次去除殘留細胞，以0 h為劃痕時間點，每隔24 h拍照記錄。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 依次按照如下步驟進行：組織切片脫蠟→抗原修復(fù)→去除過氧化物酶→封閉血清→孵育→顯色→避光蘇木素復(fù)染→脫水→蓋玻片封片。由2位病理科醫(yī)生進行評分[5]，包括4級，0級為未出現(xiàn)染色，或者<5%細胞呈現(xiàn)染色；1級為低強度染色，或者5%～20% 染色細胞；2級為中度強度染色，或者21%～50%染色陽性；3級為強染色，或者>50%染色陽性。將MDC1表達水平分為2組：MDC1高表達組(3級染色強度)與MDC1低表達組(0～2級染色強度)。

1.2.6細胞周期與凋亡分析 轉(zhuǎn)染siRNA干擾以上細胞的目的基因24 h后，用胰酶消化細胞并用10% FBS培養(yǎng)基終止消化后經(jīng)800 r/min離心5 min，棄液后用PBS沉淀離心，避光碘化丙啶染色30 min。用300 目濾網(wǎng)濾至流式上樣管，依據(jù)細胞形態(tài)調(diào)整條件上機檢測，最后利用流式細胞儀采用Multicycle軟件分析細胞周期與凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1MDC1表達與卵巢癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析 免疫組化結(jié)果顯示卵巢癌中MDC1表達集中在細胞核部位，為核蛋白(圖1)。圖1A～C分別為MDC1典型特異性染色強度強、中、弱，MDC1表達集中于細胞核部位，為核蛋白；圖1D為Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果表明MDC1高表達組預(yù)后差(P<0.05)。兩組患者FIGO分期、組織學(xué)分類、血清CA125及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05)，而年齡無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

圖1 80例卵巢癌石蠟組織切片的免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of paraffin sections of 80 ovarian cancer tissuesNote: A-C.Immunohistochemical staining of paraffin sections of ovarian cancer (immunofluorescence,×20);D.The result of high and low expression of MDC1 in Kaplan-Meier survival analysis.

表1 MDC1表達與卵巢癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析[n(%)]

Tab.1 Correlation analysis between MDC1 expression and clinicopathological features of ovarian cancer[n(%)]

Relevant factorsnMDC1 low expressionMDC1 high expressionχ2 valueP valueAge(year)<60309210.0350.852≥60501634Clinical stageⅠ-Ⅱ stage2414128.4340.004Ⅲ-Ⅳ stage56479Histological classificationSlurry554698.8860.003Non-slurry251312Serum CA125<35102834.1280.000≥3570655Lymph node metastasisNegative2071318.8080.000Positive60519

圖2 Transwell實驗檢測MDC1對細胞遷移侵襲能力的影響Fig.2 Transwell assay to examine effect of MDC1 on cell migration and invasion

圖3 MDC1 siRNA干擾后對細胞遷移侵襲能力的影響Fig.3 Effect of MDC1 siRNA interference on cell migration and invasion ability

圖4 劃痕實驗檢測MDC1干擾后對細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of scratch test on cell migration ability after MDC1 interference

GroupsG0G1G2MSNC-HO8910PM47.55±2.4122.34±0.4930.11±2.14shMDC1-HO8910PM82.88±2.188.52±1.388.60±1.72t value18.83116.34613.570P value0.0000.0000.000

2.2MDC1對卵巢癌細跑的遷移和侵襲的影響 Transwell實驗發(fā)現(xiàn)MDC1干擾細胞系shMDC1-HO8910PM穿入下室的細胞數(shù)明顯較NC-HO8910-PM減少(P<0.05，圖2)，同時siRNA干擾實驗結(jié)果也進一步證明以上結(jié)果(圖3)。劃痕實驗也顯示，shMDC1-HO8910PM的遷移能力弱于NC-HO8910 PM(P<0.05，圖4)。

2.3MDC1對卵巢癌細胞的周期與凋亡的影響 siRNA干擾MDC1 24 h后，發(fā)現(xiàn)與NC-HO8910PM比較，細胞周期G0G1細胞比例明顯增加，G2M、S細胞比例明顯減少(P<0.05)，提示MDC1促進卵巢癌細胞增殖與細胞周期的進展,見表2。

3 討論

近年來，隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)作為機體早期抵抗腫瘤過程的關(guān)鍵防線，而經(jīng)典的抑癌基因參與DNA損傷修復(fù)過程[6]。若DNA損傷后不能進行有效的修復(fù)，則DNA遺傳穩(wěn)定性改變而導(dǎo)致基因突變形成腫瘤。臨床上主要通過放化療治療手段損傷腫瘤細胞DNA來實現(xiàn)腫瘤治療[7]。

近年來，MDC1被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的進展。有研究指出MDC1參與胃癌細胞增殖和周期調(diào)控，揭示其可作為食管癌的一個潛在基因靶點[8]。而Qin等[9]研究表明MDC1影響胃癌的進展過程。此外，MDC1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程也發(fā)揮同樣的作用。本課題組前期通過分析上皮性卵巢癌的不同蛋白質(zhì)組學(xué)及其表達差異，以及與正常卵巢組織對比分析，發(fā)現(xiàn)MDC1參與DNA損傷修復(fù)過程，故推測其可能影響腫瘤的進展。雖然在不同腫瘤中MDC1的作用機制不同，但以上研究進一步揭示MDC1可能在卵巢癌進展過程發(fā)揮類似的調(diào)控機制[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，shMDC1-HO8910PM與siRNA干擾后的實驗均說明MDC1基因敲減后導(dǎo)致腫瘤細胞遷移和侵襲能力明顯減弱。而劃痕實驗也表明MDC1促進腫瘤細胞的遷移能力，以上均揭示在卵巢癌中MDC1能促進卵巢癌細胞遷移侵襲，這為臨床卵巢癌治療提供可靠的信息。此外，在宮頸癌和食道癌的研究中，MDC1對細胞周期和耐藥性有影響，但在卵巢癌中，siRNA干擾MDC1后，細胞周期G0G1細胞比例明顯增加，G2M、S細胞比例明顯減少，提示MDC1促進卵巢癌細胞增殖與細胞周期的進展。

為了進一步研究MDC1在卵巢癌中的表達位置，本研究采用免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)MDC1主要集中在細胞核部位，這也與部分研究資料證實的MDC1通過與其他蛋白相互作用來進行DNA損傷修復(fù)是一致的[11,12]。原發(fā)性卵巢癌多采用鉑類藥物，但在治療中發(fā)現(xiàn)較多患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥性。目前，研究者深入探究卵巢癌鉑類藥物耐藥機制去改善患者預(yù)后[13,14]。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)MDC1表達與卵巢癌FIGO分期、組織學(xué)分類、血清CA125及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素均有相關(guān)性，高表達提示預(yù)后差，但與發(fā)病年齡無關(guān)。故MDC1可作為分析卵巢癌預(yù)后的分子標(biāo)志物[15]。

綜上所述，MDC1的表達水平可能與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，其高表達提示預(yù)后差，同時MDC1具有促進卵巢癌遷移侵襲作用，并促進卵巢癌細胞增殖與細胞周期的進展。需要指出的是，MDC1對卵巢癌進展的機制還有待于更多的基礎(chǔ)與臨床研究去證實。