洪明陽 于園超 周 丹 曹雅明 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，沈陽 110122)

2017年全球有219萬瘧疾病例，43.5萬人死于瘧疾感染[1]。裂殖子期原蟲表面抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可阻斷原蟲侵襲紅細(xì)胞，并促進宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)理性吞噬和抗體依賴性細(xì)胞毒作用，從而抑制紅內(nèi)期原蟲裂體增殖并阻斷感染患者發(fā)病[2,3]。因此，紅內(nèi)期疫苗在預(yù)防發(fā)病和防治重癥瘧疾方面具有廣泛的應(yīng)用前景，而裂殖子期原蟲抗原為理想的紅內(nèi)期疫苗靶位。

惡性瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原1(Plasmodiumfalciparumapical membrane antigen 1，PfAMA1)位于微線體，在裂殖子侵襲紅細(xì)胞前釋放并介導(dǎo)侵襲過程[4,5]。PfAMA1蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可阻斷裂殖子體外侵襲宿主紅細(xì)胞[6]。鼠和靈長類動物的瘧疾模型研究顯示，AMA1蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生種屬特異性保護性抗體應(yīng)答[7]。瘧疾流行區(qū)患者體內(nèi)常具有自然獲得性AMA1抗體，且抗體水平與瘧疾臨床預(yù)防密切相關(guān)[8]。Ⅱ期臨床實驗顯示，PfAMA1疫苗對非洲馬里流行區(qū)1～6歲兒童的有效性為65%，提示其作為疫苗候選抗原的可行性[9]。然而，大樣本分析顯示，PfAMA1蛋白胞外區(qū)含60個多態(tài)性位點，在各流行區(qū)有200余種單倍體型[10,11]。紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原的多態(tài)性會限制其廣泛應(yīng)用。因此，全面了解PfAMA1的抗原多樣性和免疫應(yīng)答特點可為開發(fā)和應(yīng)用PfAMA1疫苗提供必要的理論依據(jù)。

PfAMA1蛋白胞外區(qū)包含DomainⅠ(DⅠ，149-302 aa)、DomainⅡ(DⅡ，320-418 aa)和DomainⅢ(DⅢ，443-509 aa)三個子結(jié)構(gòu)域[12]?？笵Ⅰ和DⅡ的抗體可阻斷裂殖子侵襲宿主紅細(xì)胞[13,14]。DⅡ結(jié)構(gòu)域具有相對保守的氨基酸序列，其內(nèi)部環(huán)形區(qū)域中含有特異性抗原表位，可被抑制瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的4G2單克隆抗體識別[6]。上述結(jié)果提示以DⅡ區(qū)域作為紅內(nèi)期疫苗候選靶點的可行性。目前，尚無中緬邊境惡性瘧原蟲流行區(qū)pfama1基因DⅡ結(jié)構(gòu)域單倍體型和抗體應(yīng)答特點的相關(guān)報道。本文通過對中緬邊境地區(qū)惡性瘧分離株pfama1基因的單倍體型進行分析，結(jié)合流行區(qū)患者血清的ELISA檢測結(jié)果，查找流行區(qū)優(yōu)勢單倍體型和其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體亞類，旨在為我國惡性瘧紅內(nèi)期疫苗的研制和應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠(北京實驗動物研究所)；Plasmodiumfalciparum3D7株和基因組DNA(gDNA)由本教研室保存。pET32a載體(Millipore，USA)，Rosetta(DE)Competent Cell、TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit(TaKaRa)；KOD-Plus Neo (ToYoBo)；限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ(NEB)；Infusion連接酶(Vazyme)，LB broth(Gibco)，快速質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads(ThermoFisher)；Protein A(Sigma)；Goat anti-Mouse IgG(H+L)、mouse anti-his tag mAb(Abcam)；Secondary Antibody HRP conjugated、PierceTMECL Plus Western blot Substrate、96孔板(ThermoFisher)；Due Set ELISA試劑盒(R&D)；辣根過氧化物酶結(jié)合的抗人IgG/IgG1/IgG2a/IgG3/IgG4抗體(Chemicon)。

1.2方法

1.2.1樣本采集和基因組DNA提取 2013～2015年，于中緬邊境地區(qū)采集30例惡性瘧原蟲感染患者指尖血制備血樣干濾紙片，另外收集123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本及非瘧疾流行區(qū)43例正常人血清樣本。TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction試劑盒提取血樣干濾紙片gDNA。

1.2.2pfama1基因DⅡ區(qū)域的PCR擴增和測序 采用引物pfama1_DⅡF (5′-GAATGTAGTTGATAAC-TGGG-3′)和pfama1_DⅡR(5′-GCTCTTTTTTCTT-CCCCCC-3′) 擴增pfama1基因(PlasmoDB ID:PF3D7_1133400)的DⅡ結(jié)構(gòu)域。反應(yīng)體系：10×KOD-Plus Neo 緩沖液1 μl，2 mmol/L dNTPs 1 μl，25 mmol/L MgSO40.8 μl，10 μmol/L 引物各 0.25 μl，KOD-Plus Neo 0.2單位，基因組DNA 模板1.0 μl。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，68℃ 延伸60 s，44個循環(huán)；68℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction試劑盒純化后，送華大基因公司測序。

1.2.3DⅡ重組蛋白表達和免疫血清制備 采用PfAMA1-DⅡ-BamHⅠ F(5′-cgcggatccTGTGAAG-ATATACCACATGTAAATG-3′)和PfAMA1-DⅡ-NotⅠ R(5′-ttttccttttgcggccgcATCTAACATTTCATCATTT-CTTGAATTTG-3′)引物擴增pfama1基因DⅡ區(qū)域。純化PCR產(chǎn)物后，采用Infusion連接酶連接入BamHⅠ和NotⅠ酶切線性化的pET32a(+)載體，構(gòu)建pET32a(+)-PfAMA1-DⅡ表達載體，轉(zhuǎn)化入Rosetta(DE)Competent Cell宿主菌，質(zhì)粒小提并測序鑒定。

PfAMA1-DⅡ重組蛋白(rPfAMA1-DⅡ)經(jīng)1 mmol/L IPTG 20℃過夜誘導(dǎo)表達。HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化后，采用10%的SDS-PAGE電泳分離。半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBS-T漂洗后，采用抗his標(biāo)簽抗體(1∶2 000)標(biāo)記和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體分別標(biāo)記一抗和二抗。ECL發(fā)光方法檢測。

6～8周齡BALB/c小鼠，隔周皮下免疫50 μg rPfAMA1-DⅡ重組蛋白(首次免疫采用完全弗氏佐劑，二次和三次免疫采用不完全弗氏佐劑)制備多克隆抗體。3次免疫后第10天收集小鼠血清，采用Protein A純化。Western blot方法檢測抗PfAMAI-DⅡ免疫血清的特異性。采用ELISA法檢測血清中抗體滴度。

1.2.4惡性瘧原蟲體外裂殖子侵襲抑制實驗 常規(guī)方法體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲[15]，并采用40% 和70% percoll分離液提取晚期成熟的裂殖體期原蟲，調(diào)整培養(yǎng)體系中原蟲血癥為1%后置于24孔板中培養(yǎng)(紅細(xì)胞壓積2.5%，總體系2 ml)。在對照組(NC)和免疫組(DⅡ)中分別加入正常小鼠IgG抗體和抗PfAMA1-DⅡ純化后的免疫血清，濃度梯度：1.5 mg/ml，0.75 mg/ml 和0.31 mg/ml。各實驗組每個濃度梯度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)10 h后，姬姆薩染色計數(shù)原蟲血癥(P)。裂殖子侵襲抑制率=100-(DⅡ組原蟲血癥均值/NC組原蟲血癥均值)× 100%。

1.2.5序列比對和單倍體型分析 以3D7株為參照，MEGA7.0軟件分析30例中緬邊境樣本pfama1基因DⅡ區(qū)域序列[16]。DnaSP v6軟件計算單倍型(number of haplotypes,H)和單倍型多樣度(haplotype diversity，Hd)[17]。

1.2.6抗體及其亞類的ELISA檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測總IgG及IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。0.5 μg/孔PfAMA1-DⅡ重組蛋白包被96孔板，4℃過夜。1%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h后，采用含0.5% Tween-20的PBS緩沖液(0.5% Tween-20/PBS)洗滌5次。每孔加入100 μl稀釋血清(總IgG，1∶200倍稀釋血清；IgG各亞類，1∶50倍稀釋血清)，37℃下孵育2 h后，采用0.5% Tween-20/PBS洗滌5次，100 μl/孔HRP結(jié)合的抗人IgG 和各亞類二抗(1∶4 000)37℃ 孵育2 h，0.5% Tween-20/PBS洗板5次后，加入50 μl/孔底物(KPL，USA)避光反應(yīng)5 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。492 nm處讀取吸光度。負(fù)截止值定義為陰性對照樣品的平均值加上陰性對照樣本的兩倍標(biāo)準(zhǔn)差?？贵w水平高于負(fù)截止值被認(rèn)為是陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 6.0軟件和SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。ELISA抗體滴度組間差異采用Student′st檢驗。IgG和其亞類的組間差異采用單向非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗?？贵w水平與單倍體型間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PfAMA1-DⅡ重組蛋白表達情況和免疫血清檢測 本研究中成功構(gòu)建了pET32a (+)-PfAMA1-DⅡ 原核表達載體，采用1 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳分析可見大量可溶性PfAMA1-DⅡ重組蛋白(rPfAMA1-DⅡ，～74.8 kD)的表達(圖1A)。使用HisPurTMNi-NTA柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進行Western blot 檢測，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶約74.8 kD(圖1A)。檢測其蛋白純度>80%，調(diào)整濃度為1.5 mg/ml(圖1A)。Western blot實驗顯示，rPfAMA1-DⅡ重組蛋白免疫小鼠后提純獲得的免疫血清(3 mg/ml)可檢測到rPfAMA1-DⅡ(圖1B)。ELISA實驗顯示，抗-PfAMA1-DⅡ免疫血清抗體滴度為1∶6 400(圖1C)。

2.2惡性瘧原蟲裂殖子侵襲抑制實驗 與正常鼠IgG處理組相比，抗PfAMA1-DⅡ抗體可顯著抑制惡性瘧原蟲裂殖子侵襲宿主紅細(xì)胞，其抑制作用呈劑量依賴性。當(dāng)抗PfAMA1-DⅡ抗體量達到2 mg/ml時，抑制率>85%，提示抗PfAMA1-DⅡ結(jié)構(gòu)域的抗體對宿主具有保護性作用(表1)。

2.3中緬邊境流行區(qū)pfama1-DⅡ區(qū)域單倍體型多樣性和單倍體型頻率分析 本研究成功擴增了30例惡性瘧原蟲分離株pfama1基因的D Ⅱ 區(qū)域297 bp 長度片段。30例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因D Ⅱ 分屬 9個單倍體型(H)，單倍型多樣度(Hd)為0.88，H4為優(yōu)勢單倍體型，頻率為26.7%(表2)。

2.4中緬邊境流行區(qū)123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本信息 2013～2015年于中緬邊境地區(qū)采集123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本?；颊吣挲g1～71歲(中位年齡24歲)，15歲以上的病例樣本約為84.55%，75.61%為男性患者(表3)。86.18%的患者有發(fā)熱癥狀(腋窩溫度>37.5℃)，75.3%的患者在發(fā)熱后3 d內(nèi)有抗瘧藥物治療史，7.32%的患者有重癥瘧疾臨床癥狀(表3)?；颊叩臒o性期原蟲密度均值9 860 μl-1(表3)。

圖1 PfAMA1-DⅡ重組蛋白表達情況和免疫原性檢測Fig.1 Expression of recombinant PfAMA1-DⅡ protein and detection of its immunogenicityNote: A.Detection of recombinant PfAMA1-DⅡ protein expression.The left panel shows the coomassie brilliant blue staining result of recombinant PfAMA1-DⅡ protein.The right panel shows the Western blot results of recombinant PfAMA1-DⅡ protein.Probed with anti-His tag mAb (1∶2 000 dilutions)；B.Western blot detection of the specificity of anti-PfAMA1-DⅡ sera；C.ELISA assay for antibody titer detection of anti-PfAMA1-DⅡ serum.Arrows indicate recombinant PfAMA1-DⅡ proteins,～74.8 kD.**.P<0.01;***.P<0.001.

表1 抗-PfAMA1-DⅡ抑制裂殖子侵襲能力檢測

Tab.1 Analysis of anti-PfAMA1-DⅡ inhibition ability of merozoite invasion

Purified IgG conc.Inhibition of invasion (%)No.1No.2No.31.5 mg/ml9288790.75 mg/ml8575570.31 mg/ml17219

表2 中緬邊境地區(qū)30例惡性瘧原蟲分離株pfama1基因單倍體型頻率分析

Tab.2 Haplotype frequency ofPlasmodiumfalciparumin 30pfama1 isolates from China-Myanmar border area

HaplotypeNo.of sequencesFrequency (%)H1413.3H2310.0H3310.0H4826.7H5413.3H626.7H713.3H8413.3H913.3

表3 中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲急性感染病例(n=123)

Tab.3 Description of acute infection cases withPlasmodiumfalciparumin China-Myanmar border areas (n=123)

IndexNumber (median)% (range)GenderMale 9375.61Female 3024.39Age distribution<10 years43.2510-15 years118.94>15 years10484.55 Missing information43.25Parasitological dataAsexual parasitemia[mean(SD)]9 86014 667Fever prevalence10686.18MalariaSevere malaria symptom97.32

2.5IgG及其亞類的ELISA檢測結(jié)果和單倍體型相關(guān)性分析 本研究檢測了123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本對PfAMA1-DⅡ蛋白的IgG抗體及其亞類產(chǎn)生水平。與正常對照組相比，45.1%(55/122)的惡性瘧原蟲患者血清中含有高水平抗PfAMA1-DⅡ的IgG抗體產(chǎn)生，提示惡性瘧原蟲感染患者體內(nèi)可產(chǎn)生抗PfAMA1抗體(P<0.000 1，圖2A)。IgG抗體亞類分析顯示，58.82%(60/102)的患者血清中IgG1抗體反應(yīng)為陽性，27.4%(34/124)

表4 中緬邊境地區(qū)H4和H5單倍體型產(chǎn)生的抗體反應(yīng)比較

Tab.4 Antibody response between H4 and H5 in China-Mynamar border isolates

Note：1)P<0.01.

圖3 中緬邊境地區(qū)PfAMA1-DⅡ抗原H4和H5單倍體型產(chǎn)生IgG4抗體水平的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation of IgG4 antibody response to H4 and H5 of PfAMA1-DⅡ antigen in China-Myanmar border area

的患者血清中IgG2抗體反應(yīng)為陽性， 38.5%(47/122)的患者血清中IgG3抗體反應(yīng)為陽性，27.1%(33/122)的患者血清中IgG4抗體反應(yīng)為陽性(圖2B～E)。上述結(jié)果提示，中緬邊境流行區(qū)惡性瘧感染患者血清中對PfAMA1-DⅡ的抗體反應(yīng)以IgG1和IgG3抗體亞類為主。此外，在22份具有基因組DNA樣本的陽性血清樣本中，檢測到4種不同的單倍型(H1、H4、H5和H8的頻率分別為1.9%、75.0%、19.2%和3.8%)。中緬邊境人群血清中抗PfAMA1蛋白的IgG1和IgG3抗體反應(yīng)對兩個主要單倍型H4和H5差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。其中，惡性瘧原蟲感染患者體內(nèi)IgG4抗體水平與H4和H5單倍體型顯著相關(guān)(r=0.844，P<0.01，圖3)。

3 討論

中國正處于消滅瘧疾的邊緣時期，但邊境地區(qū)人口流動所致瘧疾再傳播，非洲和東南亞輸入性瘧疾的威脅均使衛(wèi)生部于2020年在全國范圍內(nèi)消滅瘧疾的計劃面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[18]。目前廣泛研究的紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原均具有多態(tài)性，限制了上述抗原制備的疫苗在不同流行區(qū)間廣泛應(yīng)用。了解瘧疾疫苗候選抗原的多態(tài)性及其與抗瘧保護性免疫應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)，可為瘧疾疫苗的研制提供理論依據(jù)。

惡性瘧原蟲裂殖子抗原產(chǎn)生的自然獲得性抗體在流行區(qū)宿主抵御瘧疾感染中發(fā)揮重要作用[19]。在瘧疾低密度流行區(qū)患者體內(nèi)檢測到高水平的抗裂殖子蛋白抗體，提示裂殖子抗原具有良好的免疫原性[19]。與前期研究結(jié)果一致，在瘧疾低密度流行的中緬邊境地區(qū)，于45.1%的患者血清中檢測到抗PfAMA1的IgG抗體。此普遍存在于瘧疾感染患者體內(nèi)的抗體反應(yīng)可能是由前次感染后存留的抗原特異性記憶B細(xì)胞被激活所致[20]。同時，多項研究發(fā)現(xiàn)瘧疾流行區(qū)患者血清中抗AMA1的IgG1和IgG3抗體水平隨年齡增長逐漸升高，且與瘧疾發(fā)病率下降相關(guān)，提示調(diào)理性抗體在預(yù)防臨床瘧疾中的重要保護作用[21,22]。有研究報道抗裂殖子抗原MSP3和GLURP R2的IgG2和IgG4抗體產(chǎn)生可預(yù)防重癥臨床瘧疾發(fā)生[23]。但PfAMA1蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG2和IgG4抗體在宿主抵抗瘧疾感染中的作用尚存在爭議。有研究提示，由于缺乏激活細(xì)胞毒性細(xì)胞的能力，患者體內(nèi)抗AMA1的IgG2和IgG4抗體水平與阻斷瘧疾感染后的保護性免疫機制相關(guān)[24]。另有研究表明，IgG2和IgG4抗體與降低瘧疾發(fā)病率相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，PfAMA1蛋白DⅡ抗體可體外阻斷裂殖子侵襲宿主紅細(xì)胞，且中緬邊境流行區(qū)患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗PfAMA1-DⅡ抗體以IgG1和IgG3為主，提示以PfAMA1-DⅡ抗原制備紅內(nèi)期疫苗可誘導(dǎo)患者體內(nèi)保護性免疫應(yīng)答。

早期研究顯示AMA1所誘導(dǎo)的保護性作用是單倍體型特異性的，但由于對AMA1單倍體型多樣性尚缺乏廣泛性的研究，現(xiàn)有的AMA1疫苗都是基于惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株3D7和/或FVO株AMA1序列，從而限制了AMA1疫苗的地域性應(yīng)用價值[26,27]。前期對中緬邊境瘧疾流行區(qū)pfama1基因的多態(tài)性分析顯示，中緬邊境流行區(qū)樣本中無3D7株相同基因型，且與FVO株相同的單倍體型僅占流行區(qū)總單倍體型的5%[19]。本研究中檢測到的優(yōu)勢單倍體型H4(頻率：26.7%)與2011至2012年間普查檢測到的優(yōu)勢單倍體型H3基因序列一致，提示同一單倍體型仍廣泛流行于中緬邊境流行區(qū)[28]。聯(lián)合同一流行區(qū)患者血清學(xué)結(jié)果分析顯示，H1(頻率：1.9%)、H4(75.0%)、H5(19.2%)和H8(3.8%)感染的惡性瘧原蟲患者血清中抗體可與3D7型PfAMA1-DⅡ重組蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，提示3D7型AMA1疫苗在中緬邊境流行區(qū)具有部分保護性效果。此外，本研究發(fā)現(xiàn)單倍體型H4和H5誘導(dǎo)宿主保護性免疫應(yīng)答能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且IgG4抗體產(chǎn)生水平與H4和H5單倍體型顯著相關(guān)。鑒于H4為中緬邊境流行區(qū)優(yōu)勢單倍體型，可誘導(dǎo)IgG1和IgG3為主導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答，上述結(jié)果提示以H4作為中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲紅內(nèi)期潛在的疫苗候選有可能性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PfAMA1-DⅡ區(qū)域具有強免疫原性，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護性抗體以調(diào)理性抗體IgG1和IgG3為主。且研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的保護性抗體與3D7型PfAMA1-DⅡ重組蛋白具有交叉反應(yīng)，提示以3D7株為背景的PfAMA1疫苗在中緬邊境流行區(qū)具有保護性效果。同時，研究顯示H4可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體及其亞類，提示以此單倍體型制備PfAMA1紅內(nèi)期疫苗在中緬邊境流行區(qū)可能獲得良好的保護性效果。然而，中緬邊境地區(qū)AMA1抗原的單倍型多樣性，各單倍體型與IgG抗體亞類產(chǎn)生水平間的相關(guān)性及各IgG抗體亞類對惡性瘧原蟲生長抑制的作用效果仍需大樣本廣泛研究，從而進行綜合評價。