程 明 孫 汭 田志剛 彭 慧

(中國科學技術大學免疫學研究所，合肥 230027)

肝臟是人體的代謝器官，在調節(jié)脂肪、糖類及碳水化合物的代謝平衡中發(fā)揮重要作用。肝臟穩(wěn)態(tài)的維持和生理功能的正常行使依賴于免疫系統(tǒng)的精細調控[1]。肝臟具有獨特的供血機制，其80%左右的血液供應來源于門靜脈，其中來自于胃腸道的食物抗原、微生物及生物毒素等，使肝臟暴露于大量外來抗原之中[2]。一方面，肝臟需要識別有害抗原并引起適度的免疫反應以清除有害抗原；另一方面，需要對食物抗原等無害物質保持免疫耐受，避免產生過激的免疫反應。這種免疫平衡的建立依賴于各類固有免疫和適應性免疫細胞的參與。肝臟含有大量固有免疫細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷T(natural killer T,NKT)細胞和自然殺傷(natural killer,NK)細胞等[3]。NK細胞在肝臟免疫中扮演重要角色，可通過天然殺傷和分泌細胞因子控制病毒感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。近來研究表明人類肝臟NK細胞和外周循環(huán)NK細胞之間存在諸多差異，本文回顧了人類NK細胞的基本生物學特性、NK細胞的肝臟區(qū)域免疫特征及其在不同肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中所產生的影響。

1 人類NK細胞的基本生物學特征

1.1NK細胞的表型與功能 人類NK細胞是以CD3-CD56+為標志的大顆粒淋巴細胞[5]。CD56也被稱為神經細胞黏附分子，表達于人NK細胞和部分T細胞上[6]。小鼠NK細胞不表達CD56，自然細胞毒性受體(natural cytotoxicity receptor，NCR)家族成員NKp46是鑒別小鼠NK細胞的特異性標志[7]。然而人類CD3-CD56+NK細胞低表達或不表達NKp46，提示NKp46不能作為人類與小鼠NK細胞的共同表征分子[6]，對于跨種系NK細胞表面共同標志物的鑒定有待進一步探索。

NK細胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在對抗病原體感染和腫瘤免疫監(jiān)視中擔任著哨兵和前線防御者的角色。與T、B細胞不同，NK細胞不表達基因重排的抗原特異性受體，而是依賴一系列種系基因編碼的受體。NK細胞表面活化性受體(NKp46，NKp44、NKp30、NKG2D等)或抑制性受體(NKG2A、TIGIT、人抑制性KIR、小鼠Ly49受體等)與靶細胞上的相應配體結合，從而傳遞活化或抑制信號，二者之間的信號平衡決定NK細胞能否被活化[8，9]。正常組織細胞由于高表達MHCⅠ類分子，可與NK細胞上的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受體結合，傳遞抑制信號，從而免受NK細胞攻擊；而感染或轉化的細胞通常下調表達MHCⅠ類分子，盡管可以因此逃避MHCⅠ限制性T細胞的識別，但可減弱MHCⅠ類分子和NK細胞抑制性受體結合傳遞的抑制信號，使NK細胞激活并殺傷感染或轉化的細胞[10]。此外，NK細胞功能也受到細胞因子的調控，IFN-α/β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ可啟動NK細胞活化，而TGF-β、IL-10則可抑制NK細胞功能[11]。

NK細胞活化后可釋放穿孔素和顆粒酶等毒性物質導致靶細胞裂解，也可通過表達凋亡相關受體的配體(Fasl、TRAIL、TNF)與靶細胞表面的DR5、Fas/CD95、TNF受體1等分子相結合，進而激活靶細胞的凋亡程序[12]?；罨腘K細胞還能分泌包括IFN-γ在內的多種細胞因子參與免疫調節(jié)[13]。

1.2人類NK細胞的早期發(fā)育 T、B細胞發(fā)育分化的研究已被廣泛報道，而對于人類NK細胞早期發(fā)育階段還知之甚少。傳統(tǒng)觀點認為NK細胞來源于骨髓，骨髓基質細胞提供造血干細胞向NK細胞發(fā)育所必需的細胞因子[14-16]。近來研究發(fā)現(xiàn)在淋巴結、胸腺及肝臟中存在具有NK細胞分化潛能的早期淋巴祖細胞，提示這些器官可能是部分NK細胞髓外發(fā)育分化的場所[17-19]。

NK細胞起源于造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)，Lin-CD34+HSC向CD45RA+淋巴誘導多潛能祖細胞分化(lymphoid-primed multipotential progenitor，LMPP)[20]。在獲得CD38、CD7、CD10和細胞因子受體CD127(IL-7受體-α)的表達后，LMPP轉變?yōu)楣餐馨妥婕毎?common lymphoid progenitor，CLP)。CLP具有向Pro-B、Pre-T、NK祖細胞(NK cell progenitor，NKP)或其他固有淋巴細胞譜系發(fā)育的潛能，代表著淋巴細胞分化早期的關鍵分支點[21]。IL-15是NK細胞發(fā)育依賴的細胞因子，早期研究通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，細胞因子受體CD122(IL-2/IL-15Rβ)是NK細胞譜系發(fā)育的標志分子[22]，但近來在人的骨髓、臍帶血、扁桃體和胎兒組織中發(fā)現(xiàn)，Lin-CD34+CD38+CD123-CD45RA+CD7+CD10+CD127-NKP可以定向發(fā)育成NK細胞，與小鼠rNKP不同的是，這群細胞幾乎不表達CD122，但在體外特定細胞因子的誘導下能上調CD122的表達，提示在NKP向NK細胞分化過程中對IL-15的響應可能需要環(huán)境因素的啟動[21]。NKP進一步獲得CD56的表達象征著成熟NK細胞的產生[6]。

1.3NK細胞的亞群及分布 根據CD56分子的表達將人類NK細胞分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，它們具有不同的表型、定位和免疫功能。CD56brightNK細胞主要分布于次級淋巴組織和某些實體器官，高表達CD62L與趨化因子受體CCR7，這些分子介導淋巴細胞遷移與歸巢，可能對該亞群在體內的分布具有重要意義，而CD56dimNK細胞缺乏這些分子的表達[23,24]。另外，兩個亞群在功能性受體的表達上存在差異，CD56brightNK細胞高表達NKG2A/CD94等抑制性受體，低表達KIR與FcγRⅢ(CD16)，而上述分子在CD56dimNK細胞上的表達模式與此相反[25,26]。此外，CD56brightNK細胞的細胞因子分泌能力較強，可產生高水平的IFN-γ與GM-CSF等細胞因子。體外實驗表明，不同環(huán)境因素誘導下，CD56brightNK細胞偏好分泌不同類型的細胞因子，例如，IL-12和IL-18聯(lián)合刺激誘導CD56brightNK細胞產生IFN-γ、IL-15和IL-18刺激,誘導其產生GM-CSF，而IL-12和IL-15導致其分泌高水平的IL-10[23]。外周血中NK細胞以CD56dim亞群為主，該群體分泌細胞因子能力較弱而高表達FcγRⅢ，其通過含有免疫受體酪氨酸激活基序的相關亞基與抗體Fc段結合，介導抗體依賴的細胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)[27]。

目前關于CD56bright和CD56dimNK細胞是否代表兩個功能亞群，亦或處于NK細胞的不同發(fā)育階段仍有爭議。有觀點認為CD56brightNK細胞是CD56dimNK細胞的前體，且已找到介于這兩群細胞的中間細胞亞群[28,29]。然而，體外實驗證明CD56dimNK細胞可向CD56brightNK細胞轉化[30]，且最近的研究提示這兩群細胞為終末分化細胞并來源于不同前體[31,32]。因此，關于這兩群細胞在發(fā)育路徑上的相關性仍需進一步研究?？紤]到NK細胞表面標志物的表達易受環(huán)境因素影響而產生波動，根據單一表面標志物對NK細胞進行亞群劃分可能并不準確。

此外，根據CD27與CD11b的表達可將小鼠NK細胞成熟過程劃分為四個階段，其中雙陰性(CD27-CD11b-)NK細胞依次經歷CD27+CD11b-、CD27+CD11b+階段成為終末成熟的CD27-CD11b+NK細胞[33,34]；人類NK細胞也可基于CD27與CD11b的表達分為不同亞群，各亞群具有獨特的功能，與CD56brightNK細胞相似，CD27+CD11b+/-NK細胞具有較強細胞因子分泌能力，CD27-CD11b+NK細胞與CD56dimNK細胞相似，展現(xiàn)出較高的細胞毒活性，而CD27-CD11b-NK細胞表現(xiàn)出不成熟的表型[35]。同時，與CD27+CD11b+NK細胞相比，CD27-CD11b+NK細胞產生IFN-γ的能力下降，提示NK細胞功能在成熟過程中受到調控[36]。NK細胞成熟過程伴隨多個表面分子上調或下調表達，某一組特定表面標志物所定義的NK細胞發(fā)育階段往往與其他表面分子所定義的NK細胞亞群發(fā)生重疊，關于不同亞群之間存在的聯(lián)系有待進一步探索。

2 肝臟NK細胞

2.1人類肝臟NK細胞基本特性 20世紀70年代大鼠肝臟NK細胞首次被描述為pit細胞，其直徑介于淋巴細胞與粒細胞之間，形狀不規(guī)則且多變[37]。早期研究表明，肝臟NK細胞與外周血NK細胞在表面分子表達、細胞因子分泌能力及細胞毒活性等方面存在差異[38]。例如，肝臟NK細胞低表達成熟相關的自身主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的抑制性受體，高表達組織駐留標志CD69[39]。此外，NK細胞在人體循環(huán)淋巴細胞中占5%～15%[28]，但占人類肝臟淋巴細胞數(shù)目的50%[40]。肝臟NK細胞的相對豐富性和獨特特征提示其對于肝臟穩(wěn)態(tài)維持可能具有重要意義[41]。

人類肝臟兩個主要NK細胞亞群CD56bright和CD56dimNK細胞比例相近，肝臟CD56dimNK細胞與外周血CD56dimNK細胞有較多共同的表型和功能特征，包括CD16、KIRs和細胞毒效應分子的表達[39,42]。而肝臟CD56brightNK細胞在表面分子表達上與外周血CD56brightNK細胞有所不同，其組成性表達組織駐留標志CD69與趨化因子受體CCR5、CXCR6，這種獨特的趨化因子受體表達譜可能對其選擇性定位于肝竇至關重要[43]。

2.2人類肝臟駐留NK細胞的發(fā)現(xiàn) 最近研究表明，肝臟NK細胞是異質性群體，根據其遷移能力，人類與小鼠肝臟NK細胞可分為經典NK(conventional NK,cNK)細胞與肝臟駐留NK(liver-resident NK,LrNK)細胞，前者通過血液循環(huán)在組織間遷移，而后者則保持組織駐留特性，二者在表型及功能分子表達上均存在顯著區(qū)別[40]。目前對于小鼠LrNK細胞和cNK細胞亞群的表型區(qū)分比較明確，根據細胞表面CD49a和CD49b (DX5)的表達差異可以將小鼠肝臟NK細胞分為兩個亞群：CD49a-CD49b+cNK細胞和CD49a+CD49b-LrNK細胞[44]。小鼠LrNK細胞約占肝臟NK細胞的50%，其高表達CD69、TRAIL、CXCR6等組織駐留標志[44]。

人類LrNK細胞的表型特征與鼠中不完全相同，早期研究發(fā)現(xiàn)人類肝臟中存在CD3-CD56+CD49a+CD56brightNK細胞具有肝臟駐留特性，這群細胞轉錄因子的表達與小鼠LrNK細胞相似，高表達T-bet低表達Eomes，但其在不同個體間的表達差異較大，且在肝臟NK細胞中占比很小[42]。最近發(fā)現(xiàn)CXCR6+或CD49e-NK細胞在人體肝臟中高度富集，但它們在外周循環(huán)NK細胞中占比很低，提示CXCR6和CD49e可能是區(qū)別人類LrNK細胞和cNK細胞的潛在標志物；在轉錄因子表達方面，人類循環(huán)NK細胞高表達T-bet低表達Eomes，而肝臟CXCR6+或CD49e-NK細胞低表達T-bet，而高表達Eomes[45-48](圖1)。這些結果提示人類LrNK細胞可能是由不同表型特征的細胞亞群組成的異質性群體，其中部分表型分子在不同亞群重疊表達，有關人類肝臟駐留NK細胞的研究有待進一步展開。目前關于不同NK細胞亞群之間的譜系關系及其在肝臟疾病進程中的影響成為研究熱點[42,44]。

2.3人類肝臟ILC概述及其與NK細胞的關系 固有淋巴細胞(innate lymphoid cell,ILC)家族是高度異質性的細胞群體[49]。根據產生Th1型、Th2型和Th17細胞相關細胞因子的能力和轉錄因子表達特點，可將ILC分為三大類：1型ILC(group 1 ILC)，其表達轉錄因子T-bet并產生Th1型細胞因子IFN-γ， 包括cNK細胞，組織駐留NK細胞和ILC1；2型ILC(group 2 ILC)即ILC2，其產生Th2相關細胞因子，包括IL-5和IL-13并表達轉錄因子Bcl11b、Gata3及Rorα；3型ILC(group 3 ILC)，其與Th17細胞有相同的特征，包括轉錄因子Ahr和Rorγt的表達以及IL-17和IL-22的產生，主要包括ILC3和淋巴組織誘導(LTi)細胞[50]。穩(wěn)態(tài)下肝臟中存在的ILC主要為1型ILC，幾乎占所有ILC的95%， ILC2和ILC3數(shù)量較少，僅占所有ILC的5%[51]，關于不同ILC亞群在肝臟疾病中的功能研究已引起廣泛關注[52-54]。目前小鼠ILC發(fā)育路徑的研究較為系統(tǒng)，主流觀點認為ILC成員都起源于CLP[55]，在Nfil3(E4bp4)調控下，CLP進一步發(fā)育成為共同ILC前體(common innate lymphoid progenitors，CILP)，CILP在不同轉錄因子的引導下形成不同的發(fā)育路徑。其中，在Ets1和Eomes的調控下誘導CILP分化為cNK細胞；而Id2和Gata3的活化則會使CILP進入另一條發(fā)育路徑，形成共同輔助固有淋巴樣細胞前體(common helper innate lymphoid progenitor，CHILP) 。在T-bet等轉錄因子作用下，PLZF+的 CHILP會最終發(fā)育形成包括ILC1在內的各個ILC亞群[56]，但不能發(fā)育為cNK細胞。

圖1 人類肝臟NK細胞亞群的表型及功能Fig.1 Phenotype and function of human liver NK cell subsetsNote:Human liver NK cells contain cNK cells and LrNK cells.cNK cells express CD49e and circulate through the blood.In contrast,LrNK cells express CXCR6,CD69 and other tissue-resident molecules,but lack CD49e expression,and do not participate in blood circulation.LrNK cells and cNK cells also differ in expression of effector molecules and transcription factors.

目前，ILC1的界定較為模糊，與NK細胞亞群存在重疊。ILC1最初以功能特點來定義，用來描述能分泌IFN-γ但不具備細胞毒作用的ILC，與Th1細胞相似。近年來對ILC亞群發(fā)育源頭的追蹤研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ILC1由CHILP發(fā)育而來，且不依賴轉錄因子Eomes[13]；而NK細胞兼具IFN-γ分泌能力和殺傷功能，是CD8+T細胞在固有免疫中的對應組分，其發(fā)育依賴轉錄因子Eomes[57]。然而，目前尚無特定表型分子或轉錄因子能將1型ILC中不具備細胞毒作用的群體區(qū)分出來。在功能上，LrNK細胞盡管和cNK細胞相似，具有較強的殺傷功能[40]，但LrNK細胞在發(fā)育路徑上與cNK細胞不同，與黏膜ILC1相似，其發(fā)育依賴T-bet而不依賴Eomes，因此LrNK細胞也被稱作肝臟ILC1[56]。人類中有兩個ILC1亞群已被報道：①在扁桃體和腸上皮中發(fā)現(xiàn)的CD103+上皮內ILC1(intraepithelial ILC1，ieILC1)[58]；②產生IFN-γ但缺乏細胞殺傷功能的CD127+ILC1[59]。其中CD127+ILC1與CD56brightNK細胞均表達CXCR3、CD127等表面分子。另外通過轉錄組學和表觀遺傳學研究比較循環(huán)NK細胞和ieILC1發(fā)現(xiàn)， CD56dim細胞與CD56bright細胞幾乎沒有關聯(lián)，而CD56bright細胞與ieILC1存在一定的親緣關系[57]。因此，人類ILC1可能并不代表與NK細胞完全不同的譜系，而是具備某種特定功能狀態(tài)的細胞亞群(例如分泌IFN-γ)。

盡管目前普遍認為ILC1與cNK細胞在發(fā)育譜系上不同，但近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境高水平的TGF-β促進CD49a-CD49b+Eomes+cNK細胞轉變?yōu)镃D49a+CD49b-EomesintILC1最終導致腫瘤細胞的免疫逃逸[60]，提示在特定環(huán)境下cNK細胞可轉變?yōu)镮LC1，因此，ILC1與cNK細胞究竟是兩個完全獨立的細胞亞群還是不同環(huán)境下呈現(xiàn)的不同狀態(tài)，這仍有待進一步研究。

3 肝臟NK細胞與肝臟疾病

大量研究表明NK細胞對于肝臟的免疫防御和疾病控制至關重要。一方面NK細胞在抗病毒感染、延緩肝纖維化進程和抑制腫瘤細胞生長中對機體發(fā)揮有利作用，另一方面也能導致肝細胞損傷，并負調適應性免疫系統(tǒng)抗病毒應答，從而對機體產生不利影響。

3.1病毒性肝炎

3.1.1乙型肝炎病毒感染 全世界約有2.4億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)[61,62]。HBV感染可導致多種肝臟疾病，如急性自限性肝炎、暴發(fā)性肝炎伴肝功能衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌[61,63]。盡管適應性免疫反應被認為是決定HBV感染進程的關鍵因素[64]，但在HBV感染的早期或免疫清除階段，NK細胞表現(xiàn)出活化的表型和增強的效應功能[65,66]，且NK細胞來源的IFN-γ可有效阻止HBV的持續(xù)感染[67]，說明在感染早期NK細胞對于疾病控制至關重要。值得注意的是，激活的NK細胞在抗病毒過程中可能造成肝臟損傷[65]。NK細胞履行其作為固有免疫細胞職責的同時，也參與調節(jié)適應性免疫應答。HBV感染小鼠模型中，肝臟NK細胞通過分泌IFN-γ來介導CD8+T細胞的活化，且發(fā)揮這一作用的主要是cNK細胞，而NKG2A+LrNK細胞可能對cNK細胞IFN-γ的分泌起抑制作用[68,69]。這提示IFN-γ對于NK細胞抗病毒非常重要，其既可以直接抑制HBV復制[70]，又可以激活適應性免疫系統(tǒng)從而控制疾病發(fā)展。然而，HBV患者外周血抑制性單核細胞通過PD-L1/HLA-E分別與NK細胞上PD-1/CD94相互作用誘導產生調節(jié)性NK細胞，其分泌IL-10抑制適應性免疫應答[71]。此外，NK細胞還能通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的信號通路來調節(jié)病毒特異性CD8+T 細胞，表達TRAIL死亡受體2(TRAIL-R2)的HBV特異性CD8+T細胞與NK細胞表面TRAIL相互作用，導致病毒特異性CD8+T細胞凋亡[72,73]。由于LrNK細胞組成性高表達TRAIL[74]，提示LrNK細胞可能是通過TRAIL信號負調T細胞功能的主要因素。

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者體內，NK細胞上調表達抑制性受體，下調表達活化性受體，因而處于功能低下的狀態(tài)。Siglec-9作為一種MHCⅠ類分子非依賴的抑制性受體，選擇性表達于CD56dimNK細胞，CHB患者肝細胞上Siglec-9配體表達上調，增強NK細胞抑制性信號，使NK細胞分泌細胞因子能力降低，通過抗體阻斷Siglec-9信號通路增強NK細胞效應功能可能有助于控制HBV感染[75]。另外CHB患者外周血NK細胞高表達NKG2A，處于免疫抑制狀態(tài)。通過HBV小鼠模型對此現(xiàn)象進行探索發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟調節(jié)性CD4+T細胞分泌的IL-10可誘導NK細胞表達NKG2A，阻斷NKG2A可以逆轉NK細胞的耐受狀態(tài)，增強其細胞毒作用，進而促進HBV清除，相同現(xiàn)象在人類NK細胞上也得到驗證[76，77]。此外，CHB患者體內高水平的TGF-β導致NK細胞上活化性受體NKG2D、2B4表達下調，NK細胞殺傷活性減弱[78]。這些結果說明CHB患者體內免疫抑制性細胞因子對于NK細胞的表型及功能具有塑造作用，并且針對NK細胞高表達的抑制性受體使用相應抗體阻斷可以有效逆轉NK細胞的抑制狀態(tài)從而控制疾病的發(fā)展。

在CHB感染中，不同的NK細胞亞群所起的作用可能并不相同，產生IFN-γ的NK細胞限制了病毒感染，而偏向于細胞毒功能的NK細胞一方面殺傷感染細胞延緩疾病進程，但同時可能加重肝臟損傷和限制抗病毒T細胞反應來加速疾病進展。此外，在慢性HBV感染過程中，NK細胞上調表達相關抑制性受體表現(xiàn)出功能低下的狀態(tài)，這是否是為了平衡NK細胞可能造成肝臟損傷的一種補償措施，這些受體的表達變化是具有亞群特異性還是普遍發(fā)生的現(xiàn)象依然有待探索。

3.1.2丙型肝炎病毒感染 全世界超過1.85億人為丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)慢性感染患者[79]。在HCV感染過程中，只有15%～20%的成人自發(fā)清除病毒，大部分發(fā)展為慢性感染患者，其中一部分感染患者進一步發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[80]。NK細胞對于HCV感染的控制同樣重要，早期研究證實，編碼 NK細胞抑制性受體KIR2DL3及其配體HLA-C1的基因與HCV感染的自發(fā)緩解有關[81]。這種現(xiàn)象的一個可能解釋是KIR2DL3與HLA-C1相互作用介導的NK細胞抑制可能比其他KIR-HLA所介導的抑制作用弱。而KIRs家族的活化性受體KIR3DS1分子與配體HLA-F結合后可以激活NK細胞的功能。在HCV感染者原代肝組織中，HLA-F在HCV感染細胞表達上調，體外實驗證實KIR3DS1+NK細胞相較于KIR3DS1-NK細胞展示出更強的抑制HCV復制的能力，提示KIR3DS1和HLA-F之間的相互作用有助于NK細胞控制HCV感染[82]。上述研究說明KIRs及其HLA配體的表達模式影響NK細胞抵抗HCV感染的能力。

NK細胞在HCV感染的急性期被激活，其活化性受體NKG2D表達上調，IFN-γ分泌能力和細胞毒作用增強，從而殺傷HCV感染的肝細胞[83]。而在慢性HCV患者中，NK細胞展現(xiàn)出功能上的二分法：增強的細胞毒效應及減弱的細胞因子分泌能力[84]。慢性HCV感染階段，NK細胞高表達NKp30、NKp44、NKp46及NKG2D等活化性受體[84-86]，這可能有助于提高HCV感染過程中NK細胞的毒效應功能。另外患者肝臟NK細胞高表達TRAIL可誘導HCV感染的肝細胞凋亡，從而控制HCV的感染[86,87]。NK細胞上TRAIL的表達受到多種因素的調控，來自慢性HCV感染患者病變肝臟組織中的IL-26上調NK細胞上TRAIL的表達[88]；而單核細胞來源的IL-18結合蛋白a(IL18BPa)與IL-36受體拮抗劑(IL36RA)可以抑制NK細胞表達TRAIL[89]。來自肝臟微環(huán)境中的其他因素對NK細胞的功能調控同樣重要，HCV感染的肝細胞或單核來源的細胞可以通過OX40L-OX40軸與NK細胞直接接觸誘導其活化[90]。近來關于microRNA的研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染者中microRNA-155的重組導致NK細胞下調表達T-bet/Tim-3并產生IFN-γ，促進HCV的清除[91]。以上結果表明，在慢性HCV感染過程中，NK細胞呈現(xiàn)出較強的細胞毒作用對HCV的控制起到一定促進作用，同時也存在造成肝臟損傷的風險。NK細胞在慢性疾病中受到多種環(huán)境因素的調控可能有利于其在控制疾病進程與造成肝臟損傷之間找到平衡點。

此外，目前關于HCV的研究當中，NK細胞的功能分析主要通過外周血NK細胞來完成，由于人類肝組織標本難以獲取，針對HCV慢性感染小鼠模型中NK細胞的研究顯得尤為重要。在模擬HCV感染的挪威大鼠肝炎病毒感染模型中，肝臟NK細胞的數(shù)量及IFN-γ的產生在病毒感染后都顯著增加，且擴增的細胞主要是cNK細胞，而LrNK細胞的數(shù)量保持穩(wěn)定。在NK細胞清除3 d后，病毒血癥明顯加重，但病毒清除能力和肝損傷的程度并沒有發(fā)生顯著改變[92]。因此，該模型中NK細胞在感染早期起到了一定抗病毒作用，但后期病毒的清除可能并不主要依賴于NK細胞。構建表達人的occludin蛋白及CD81的近交系ICR小鼠HCV持續(xù)性感染模型發(fā)現(xiàn)，肝臟CD49b+cNK細胞高表達抑制性受體NKG2A，促進CD8+T細胞應答的能力受到抑制，使得機體不能有效清除HCV[93]。NK細胞在兩種模型中相反的作用可能與建模過程和疾病研究的時間點有關。隨著對NK細胞的認識逐漸深入，研究不同肝臟NK細胞亞群在HCV感染中所扮演的角色將成為趨勢[94]。

3.2肝纖維化 肝纖維化是以膠原蛋白為代表的細胞外基質蛋白過度積累所致，而膠原蛋白主要來自活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)、門靜脈成纖維細胞和骨髓來源的肌成纖維細胞，可由各種慢性肝臟疾病引發(fā)[95]。NK細胞在肝臟纖維化過程中扮演了雙重角色，一方面NK細胞可以通過NKG2D、NKp30或TRAIL依賴的途徑殺死應激的肝細胞，加重肝損傷[96]；另一方面，NK細胞可通過產生IFN-γ直接誘導HSC凋亡，也可通過TRAIL殺傷活化的HSC，從而抑制纖維化進展[97,98]。

肝纖維化是HBV/HCV相關性肝損傷的終末期表現(xiàn)，CHB患者的外周血與肝臟中出現(xiàn)高比例的KLRG1+NK細胞，其表面高表達的TRAIL可以結合HSC表面的DR5，從而誘導HSC的凋亡。同時，HSC所產生的骨橋蛋白與KLRG1+NK細胞表面CD44相互結合，從而促進KLRG1+NK細胞產生IFN-γ，延緩肝纖維化的發(fā)展[99]。此外，慢性HCV感染所誘導的肝臟炎癥環(huán)境可能會導致肝臟較低的氧氣水平[100]，而組織中的低氧環(huán)境已被證明可以調節(jié)NK細胞的功能[101]。但研究發(fā)現(xiàn)，在體外低氧環(huán)境下，NK細胞活化性受體NKp46、NKG2D表達下調，分泌IFN-γ和抗病毒能力下降，而殺傷活化的HSC的能力幾乎不受影響，提示低氧環(huán)境對NK細胞分泌細胞因子和殺傷HSC的能力影響程度不同[102]。上述研究說明，在慢性HBV/HCV感染向肝纖維化進展的過程中，NK細胞對于HSC的殺傷作用可有效延緩疾病的進程，其內在機理和調控因素值得進一步探究。

3.3腫瘤 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，其發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV的慢性感染以及脂肪肝的疾病進展有關[103]。近十年來，肺癌、結腸癌和前列腺癌等癌癥的發(fā)病率都有所下降，而肝癌的發(fā)病率逐年上升，已成為全球癌癥相關死亡的主要原因之一[104]。與其他器官相比，NK細胞在健康肝臟中富集，肝臟NK細胞殺傷活性的增強對肝臟腫瘤的免疫監(jiān)測不可或缺。其中NK細胞活化性受體NKG2D對NK細胞識別和清除腫瘤具有非常重要的作用[105]，但肝癌組織NKG2D配體表達下調，從而逃避NK細胞的免疫監(jiān)視，靶向轉錄抑制因子EZH2可上調NKG2D配體的表達，從而增強NK細胞對肝癌細胞的殺傷作用[106]。除了細胞間直接接觸，活化的NK細胞產生IFN-γ對于抗腫瘤免疫同樣具有積極作用[107]。然而，在HBV轉基因小鼠模型中，肝臟NK細胞來源的IFN-γ通過EpCAM-EMT軸卻促進了HCC的發(fā)生[108]，這提示NK細胞產生的IFN-γ可能在慢性炎癥向HCC轉化中起促進作用，而在后期發(fā)揮抗腫瘤作用。

在HCC患者中，多種細胞作用于NK細胞影響其抗腫瘤功能。肝癌患者髓系來源的抑制細胞(MDSCs)以接觸依賴的方式直接抑制NK細胞的細胞毒作用和細胞因子的產生[109]。此外，腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞增多，可能抑制腫瘤浸潤的NK細胞產生IFN-γ并減弱其殺傷能力[107]。而經過多靶點激酶抑制劑索拉非尼處理的巨噬細胞與NK細胞共培養(yǎng)可以誘導NK細胞的活化與擴增[110]。HCC的發(fā)生過程往往伴隨抑制性細胞的產生，這些細胞通過直接接觸或者分泌細胞因子的方式負調免疫系統(tǒng)中的效應細胞，進而加速HCC的進程。針對細胞間復雜調控網絡的研究對于了解NK細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中功能狀態(tài)的變化尤為必要。

免疫卡控點阻斷療法是近年來腫瘤治療領域的重要突破，基于逆轉NK細胞功能耗竭的免疫卡控點療法可能為HCC的治療提供新思路。HCC患者肝組織中，NKG2A高表達的CD56dimNK細胞與瘤內肝癌組織表達的NKG2A配體HLA-E相互作用，使NK細胞功能耗竭，并與不良愈后相關[111]。對HCC患者樣本進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，編碼CD96和LAG-3等抑制性卡控點受體的基因在CD49a+NK細胞上的表達水平顯著高于CD49a-NK細胞，研究表明，CD96和LAG-3在免疫細胞上的高表達使其呈現(xiàn)一種功能耗竭表型從而造成了腫瘤的免疫逃逸[112,113]，CD49a+NK細胞在肝臟腫瘤中的積累可能會導致疾病狀況惡化和愈后較差[114]。此外，小鼠LrNK細胞高表達的抑制性受體PD-L1與肝臟T細胞表面的PD-1結合進而抑制適應性免疫應答，通過阻斷PD-1-PD-L1軸可有效恢復T細胞功能[74]。這些發(fā)現(xiàn)為HCC臨床治療提供了新的靶標。同時，免疫卡控點阻斷通過增加免疫系統(tǒng)的活性可能會產生炎癥副作用[115]，所以，進行免疫卡控點阻斷治療的患者需要進行多方面的風險評估以降低臨床治療可能帶來的負面影響。

圖2 人類肝臟NK細胞與肝臟疾病的關系

Fig.2 Relationship between human liver NK cells and liver disease

Note: Human liver NK cells play an important role in the development of HBV/HCV infection,liver fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC).During acute hepatovirus infection,activated NK cells kill virus-infected target cells and release effector cytokines to control virus infection,but over-activation of NK cells may cause liver damage.However,in chronic infectious disease and HCC,NK cells gradually become exhausted with disease progression.

4 總結與展望

肝臟作為最大的實體器官，具有獨特的免疫學特性，肝臟含有包括NK細胞在內的大量淋巴細胞[116]，穩(wěn)態(tài)下肝臟NK細胞與外周NK細胞顯著不同，其表現(xiàn)出獨特的表型和功能特征且具有肝臟特異性[41,117]。以往研究表明肝臟NK細胞在病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用(圖2)。對于肝臟疾病患者的肝臟NK細胞進行表型與功能的全面研究為肝臟疾病治療提供了新思路。目前，關于人類與小鼠肝臟NK細胞亞群的研究又將NK細胞進一步劃分為cNK細胞和LrNK細胞[40,44]，探索不同肝臟NK細胞亞群在肝臟疾病中的分工可能成為未來的研究熱點。此外，在慢性噬肝病毒感染和肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中，NK細胞往往處于免疫抑制的狀態(tài)，針對NK細胞上的抑制性受體開發(fā)相關阻斷抗體或拮抗劑，可以逆轉NK細胞的耗竭狀態(tài)并恢復NK細胞的功能，從而控制疾病的發(fā)展；然而NK細胞的過度活化可能誘使肝細胞死亡，加重肝臟損傷，因此，在評估免疫卡控點阻斷療法時，需要綜合考慮NK細胞潛在的價值和風險。