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        輻照輔助接枝反應(yīng)提高大豆蛋白乳液凍融性質(zhì)

        2020-07-13 11:48:50王玉瑩張安琪周國衛(wèi)王喜波
        食品科學 2020年11期
        關(guān)鍵詞:出油率接枝凍融

        王玉瑩,張安琪,王 琳,周國衛(wèi),徐 寧*,王喜波*

        (東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)是蛋白質(zhì)量分數(shù)90%以上的全價蛋白質(zhì),由于其具有兩親性質(zhì),可以吸附在油-水界面以穩(wěn)定乳液,常被用作乳化劑[1-2]。但是蛋白質(zhì)乳液易受到外界因素的干擾,影響乳液穩(wěn)定性。如乳液在經(jīng)過凍融循環(huán)后,形成的冰晶會刺破界面膜,打破油-水的平衡,出現(xiàn)乳析、出油等失穩(wěn)現(xiàn)象[3]。

        接枝反應(yīng)是一種常用的蛋白質(zhì)改性方法,加入糖鏈可增加油-水界面的厚度,增加空間位阻,有效地改善蛋白乳液的凍融穩(wěn)定性[4-5]。改性蛋白的疏水側(cè)鏈還能提高溶解性、乳化性等功能特性[6]。輻照作為一種新型的冷加工技術(shù),具有高效率、低耗能、低成本、環(huán)保等特點,因此具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。1980年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織、國際原子能機構(gòu)、世界衛(wèi)生組織宣布,輻照劑量在10 kGy以下認定為沒有毒理學危險;1997年世界衛(wèi)生組織廢除10 kGy的上限劑量;2003年國際食品法典委員會宣布在保證食品的感官特性、功能特性、結(jié)構(gòu)完整性和安全性的情況下,食品輻照劑量可高于10 kGy[7]。這從法規(guī)上保證了輻照技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。輻照除了應(yīng)用于食品的殺菌和保鮮領(lǐng)域外,也能在蛋白質(zhì)制取和貯藏過程中改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象進而影響蛋白質(zhì)的乳化性、持油性、持水性等理化性質(zhì)[8-9]。研究表明,SPI和大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)10 kGy的γ射線輻照后,乳化特性均有所改善[10]?;ㄉ鞍捉?jīng)輻照后,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變,蛋白分子結(jié)構(gòu)展開,疏水基團暴露,導(dǎo)致各種功能性質(zhì)均有所改善,但輻照劑量進一步增加時,致敏蛋白抗原性降低[11]。血漿蛋白經(jīng)過1、5、7、10 kGy的γ輻射后有序結(jié)構(gòu)減少,多肽鏈出現(xiàn)初始斷裂和隨后的聚集,輻射改變了血漿蛋白粉末和溶液的物理化學性質(zhì)[12]。可見,輻照通過改變蛋白分子結(jié)構(gòu)來改善蛋白質(zhì)的功能特性。

        輻照技術(shù)由于作用時間短、耗能低、效率高,逐漸發(fā)展為一種改性修飾方法。同時糖基化修飾等也可實現(xiàn)蛋白質(zhì)改性,將輻照與糖基化相結(jié)合的研究鮮見報道。本實驗利用輻照輔助接枝反應(yīng)來提高SPI乳液的凍融特性,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、出油率測定和光學顯微結(jié)構(gòu)觀察對改性產(chǎn)物進行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析,以期拓寬蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域,為綜合改性技術(shù)提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        脫脂豆粉 武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司;麥芽糖(maltose,M) 北京化學試劑廠;大豆油 九三糧油工業(yè)集團有限公司;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        FJ300S-數(shù)顯高速分散均質(zhì)機 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司;高壓均質(zhì)機 北京同和友德科技有限公司;高速冷凍離心機 長沙湘銳離心機有限公司;紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;恒溫磁力攪拌器 常州市凱航儀器有限公司;MS104TS分析天平上?;ǔ睂崢I(yè)有限公司;冷凍干燥機 江蘇天翎儀器有限公司;DYY-12電腦三恒多用電泳儀 北京君意儀器廠;ST5凝膠成像儀 上海銀澤儀器設(shè)備有限公司;數(shù)顯型恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;YS-100YS-100生物顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 SPI的制備

        將100 g脫脂豆粉溶于1 000 mL去離子水中,攪拌均勻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5,離心后收集上清液,用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5,4 ℃靜置過夜。棄去上清液后離心得沉淀。用去離子水洗滌3 次,將洗滌得到的沉淀用去離子水復(fù)溶后,再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,然后進行冷凍干燥得SPI[13],凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)量分數(shù)為90.23%。

        1.3.2 輻照糖基化SPI的制備

        將SPI與麥芽糖按照質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液,25 ℃下攪拌4 h,配成一定蛋白質(zhì)量分數(shù)(2%、3%、4%、5%、6%)的溶液(SPI+M)。加入少量的疊氮鈉(終質(zhì)量分數(shù)0.02%)以防滋生微生物,置于4 ℃冰箱中水化過夜。第2天取出后室溫下攪拌直至液體溫度至25 ℃,取樣品溶液100 mL置于輻照裝置(輻射源60Co γ)下進行輻照反應(yīng)(輻照劑量為2.5、5、7.5、10、12.5 kGy)。輻照后樣品,冷凍干燥制成干粉即為輻照糖基化SPI(SPI-M)。

        1.3.3 接枝度測定

        取2 0 0 μ L樣品加入4 m L鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)試劑中混合均勻后于35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min,于340 nm波長處測吸光度A340nm,另取200 μL去離子水加入OPA試劑中作為空白對照。OPA試劑現(xiàn)用現(xiàn)配(取80 mg OPA、2 mL甲醇溶液、5 mL質(zhì)量分數(shù)20%的SDS溶液、50 mL硼砂溶液、100 μL β-巰基乙醇混合均勻,定容至50 mL)。接枝度按式(1)計算。

        式中:A0為空白對照溶液吸光度;A1為接枝反應(yīng)后溶液吸光度。

        1.3.4 褐變程度測定

        配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL樣品溶液,以去離子水為空白對照,于420 nm波長處測吸光度,以吸光度表征褐變程度。

        1.3.5 SDS-PAGE分析

        分別使用質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠和13%的分離膠進行SDS-PAGE。取20 μL樣品溶液與5 μL上樣緩沖液混合,沸水浴5 min。冷卻至室溫,取9 μL樣品溶液注入點樣孔。濃縮膠電壓設(shè)置為90 V,進入分離膠后改為120 V,直至溴酚藍距離凝膠底部0.5 cm左右結(jié)束電泳,關(guān)閉電源,起膠。分別用考馬斯亮藍染色液和Schiff試劑進行蛋白質(zhì)和糖蛋白染色[14]。

        1.3.6 乳液制備及凍融循環(huán)

        配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL樣品溶液,將樣品溶液與大豆油按體積比9∶1混合,11 000 r/min均質(zhì)3 min形成粗乳液,再通過60 MPa高壓均質(zhì)形成微乳液。將乳液加入10 mL塑料管內(nèi),于-18 ℃冰箱中冷凍24 h后在水浴鍋中解凍2 h,如此連續(xù)進行3 次凍融循環(huán)[15-16]。

        1.3.7 乳析指數(shù)測定

        乳析指數(shù)按式(2)計算。

        式中:HS表示乳清層高度/cm;HT表示乳液總高度/cm。

        1.3.8 出油率測定

        參考Palanuwech等[17]的方法,略作改動。取8 g樣品乳液與2 g蘇丹III油溶液混勻,10 000×g離心20 min,取上層液于508 nm波長處測定吸光度,大豆油為空白,調(diào)零吸光度。出油率按式(3)計算。

        式中:m0為蘇丹III油溶液質(zhì)量/g;me為乳液質(zhì)量/g;a為蘇丹III油溶液吸光度與離心后蘇丹III油溶液吸光度的比值;ωd為乳液中油相的質(zhì)量分數(shù)/%。

        1.3.9 光學顯微鏡觀察

        將待測樣品乳液搖勻后取10 μL置于載玻片,蓋上蓋玻片后置于顯微鏡觀察區(qū),將目鏡調(diào)為400 倍進行觀察。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        所有實驗均重復(fù)3 次,用平均值±標準偏差表示結(jié)果,運用SPSS Statistics 20軟件進行Pearson相關(guān)性分析,采用Origin 8軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SPI與麥芽糖質(zhì)量比對接枝物凍融特性的影響

        固定SPI質(zhì)量分數(shù)為4%,輻照劑量5 kGy,研究m(SPI)∶m(M)對接枝物凍融特性的影響。乳析指數(shù)是反映乳液凍融特性的重要指標之一,乳液乳析指數(shù)越低,凍融特性越穩(wěn)定[18]。由圖1可知,糖的引入明顯降低了乳析指數(shù),并且經(jīng)歷了3 次凍融循環(huán)后,m(SPI)∶m(M)為4∶1的乳液乳析指數(shù)最低,這是因為當反應(yīng)體系中糖的含量適量時,糖分子移動空間變大,適量的糖與蛋白分子充分接觸發(fā)生接枝反應(yīng),乳析指數(shù)降低。這與圖2的褐變程度和接枝度變化成反比,接枝度越高,乳析指數(shù)越低,凍融穩(wěn)定性增加。隨著麥芽糖含量的降低,褐變程度和接枝度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,說明美拉德反應(yīng)程度逐漸增加,但隨著麥芽糖含量的減少,較少的糖不足以與蛋白分子發(fā)生反應(yīng),糖基化反應(yīng)程度降低[19]。考慮到凍融穩(wěn)定性,選取m(SPI)∶m(M)為4∶1進行實驗,與同類研究[20-21]相比,糖的添加量減少了71%和77.8%,節(jié)約成本。

        圖1 m (SPI)∶m(M)對輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of m(SPI)/m(M) ratio on creaming index of irradiated SPI-M

        圖2 m (SPI)∶m(M)對輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 2 Effect of m(SPI)/m(M) ratio on grafting reaction and browning degree of irradiated SPI-M

        2.2 SPI質(zhì)量分數(shù)對接枝物凍融特性的影響

        固定m(SPI)∶m(M)4∶1,輻照劑量5 kGy,研究SPI質(zhì)量分數(shù)對接枝物凍融特性的影響。由圖3可知,隨SPI質(zhì)量分數(shù)的增加,乳析指數(shù)與對照組相比均明顯降低,在質(zhì)量分數(shù)為4%時乳析指數(shù)最低,表現(xiàn)出最佳的凍融特性,這與王喜波等[22]的研究結(jié)果類似。由圖4可知,接枝度在質(zhì)量分數(shù)4%時最大,為29.7%,褐變程度也適中??赡苁且驗殡S著SPI質(zhì)量分數(shù)增加,自由氨基濃度增大,提高了自由氨基與糖分子的碰撞幾率,更易發(fā)生接枝反應(yīng),但濃度過高時蛋白質(zhì)聚集,使得自由氨基含量降低[23]。適量的濃度促進了接枝反應(yīng),增加了界面膜的厚度,有效抵御了外界因素的干擾,乳液最穩(wěn)定[24]??紤]到凍融穩(wěn)定性,選取SPI質(zhì)量分數(shù)為4%進行實驗。

        圖3 SPI質(zhì)量分數(shù)對輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 3 Effect of SPI concentration on creaming index of irradiated SPI-M

        圖4 SPI質(zhì)量分數(shù)對輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 4 Effect of SPI concentration on grafting degree and brown degree of irradiated SPI-M

        2.3 輻照劑量對接枝物凍融特性的影響

        圖5 輻照劑量對輻照SPI-M乳析指數(shù)的影響Fig. 5 Effect of irradiation dose on creaming index of irradiated SPI-M

        圖6 輻照劑量對輻照SPI-M接枝度和褐變程度的影響Fig. 6 Effect of irradiation dose on grafting degree and browning degree of irradiated SPI-M

        固定SPI質(zhì)量分數(shù)4%,m(SPI)∶m(M)為4∶1,研究輻照劑量對接枝物凍融特性的影響。輻照提供的能量促使蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵等配位鍵發(fā)生斷裂或重建,使蛋白分子發(fā)生脫氨、脫羧等一系列反應(yīng),進而改變蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)及聚集程度,使蛋白分子的功能特性發(fā)生變化[25-26]。由圖5可知,輻照處理后樣品的乳析指數(shù)明顯降低,7.5 kGy處理組的乳液表現(xiàn)出最佳的凍融特性。由圖6可知,隨輻照劑量增加,接枝度先增加后降低,在7.5 kGy處理組接枝度最大,為34.56%。可能是因為輻照處理后,蛋白分子展開程度增加,柔性變大,釋放出更多的疏水基團,從而增強油-水界面的吸附作用,使得蛋白分子展開,形成較厚的保護膜,阻止了尖銳的冰晶破壞油-水界面的平衡,進而提高了乳液的凍融穩(wěn)定性[27]。由圖6可知,褐變程度隨輻照劑量的增加而變大,樣品的顏色變深,積累過多類黑精會影響產(chǎn)物感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值。綜合考慮,選取輻照劑量為7.5 kGy進行實驗。

        2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,運用SPSS Statistics 20軟件對接枝度和乳析指數(shù)進行Pearson相關(guān)性分析,由表1可知,接枝度與凍融后的乳析指數(shù)具有顯著相關(guān)性。表明樣品乳析指數(shù)降低與發(fā)生接枝反應(yīng)有關(guān)。

        表1 接枝度和乳析指數(shù)間相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between grafting degree and creaming index

        2.5 接枝物性質(zhì)分析結(jié)果

        根據(jù)單因素試驗結(jié)果,優(yōu)化的SPI-M的最佳制備條件為m(SPI)∶m(M)為4∶1、SPI質(zhì)量分數(shù)4%和輻照劑量7.5 kGy,在此條件下進行驗證實驗并設(shè)對照組。

        2.5.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

        圖7 SPI及SPI+M、輻照SPI、輻照SPI-M的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE of SPI and SPI + M, radiated SPI, and radiated SPI-M

        SPI與糖發(fā)生接枝反應(yīng)形成共價復(fù)合物可以通過分析考馬斯亮藍和Schiff試劑染色形成的電泳圖譜得到證實[28]。由圖7可知,泳道2和泳道1條帶類似,說明SPI單純地與麥芽糖混合不會發(fā)生接枝反應(yīng)。泳道3與泳道1條帶類似,說明輻照基本不會改變蛋白分子質(zhì)量。泳道4亞基組分條帶顏色變淺,這是因為考馬斯亮藍與自由氨基形成非共價鍵而呈現(xiàn)顯色反應(yīng),當SPI與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,自由氨基含量減少,剩余較少的氨基不足以與考馬斯亮藍發(fā)生顯色反應(yīng),從而證實SPI與麥芽糖發(fā)生接枝反應(yīng)。Schiff試劑染色對糖蛋白比較敏感,能夠表征美拉德反應(yīng)[29],糖染色原理為高碘酸氧化糖基化蛋白糖鏈上相鄰兩個碳上的羥基為醛基,醛基與Schiff試劑生成顏色絡(luò)合物。泳道5與泳道6相比,泳道5糖染色各亞基條帶幾乎消失,而泳道6出現(xiàn)糖染色條帶,表明發(fā)生接枝反應(yīng)。這是因為輻照促使蛋白結(jié)構(gòu)打開,暴露出更多的氨基與糖發(fā)生反應(yīng)形成接枝物[30]。

        2.5.2 出油率分析結(jié)果

        圖8 SPI及SPI+M、輻照SPI、輻照SPI-M凍融循環(huán)3 次的出油率Fig. 8 Oil release rates of SPI, SPI + M, radiated SPI and radiated SPI-M after 1, 2 and 3 freeze-thaw cycles

        乳液經(jīng)凍融處理后,脂肪的不穩(wěn)定作用會使乳液油相與水相分離,通過出油率來表征乳液的穩(wěn)定性[31]。由圖8可知,經(jīng)過凍融循環(huán)后,SPI和SPI+M樣品乳液的出油率明顯增加,可見單純地混入糖并不能明顯改善樣品乳液的凍融特性。在歷經(jīng)凍融循環(huán)后,只經(jīng)過輻照處理的SPI出油率比對照雖有所改善,但效果并不理想。而輻照處理得到的SPI-M接枝物樣品乳液經(jīng)過1、2、3 次凍融循環(huán)后出油率與SPI乳液相比分別降低了9.7%、21.2%和26.4%。可能是因為接入的糖改善了蛋白樣品乳化性,促使油-水表面形成具有彈性的界面膜,同時增加了黏度,減緩油滴的運動速度,避免了油滴之間的聚集,降低了出油率。Zhang Zeyu等[32]利用超聲協(xié)同接枝反應(yīng)處理乳液得到了類似結(jié)果,說明輻照輔助接枝反應(yīng)能改善乳液的凍融特性。

        2.5.3 光學顯微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

        由圖9可知,在經(jīng)歷凍融循環(huán)后,由SPI和SPI+M制備的乳液微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了較為明顯的改變,出現(xiàn)大而圓的油滴和不規(guī)則的團塊。經(jīng)過輻照的SPI乳液較SPI和SPI+M乳液出現(xiàn)了較小的油滴,而輻照處理得到的SPI-M接枝物的乳液更穩(wěn)定,在經(jīng)過凍融循環(huán)后蛋白形狀完整,表面光滑圓潤,邊界明顯,只出現(xiàn)較少的小油滴。可能是因為輻照促進糖的接入,形成了致密的保護膜,減少了外界因素對乳液的損壞,分子柔性也隨之增加,乳化性提高,進而降低了油滴之間的碰撞幾率,減少了絮凝和聚結(jié)[33]。因而SPI-M制備的乳液結(jié)構(gòu)變化穩(wěn)定,說明輻照輔助接枝反應(yīng)處理蛋白樣品乳液能表現(xiàn)出良好的凍融特性。

        圖9 SPI及SPI+M、輻照SPI、輻照SPI-M凍融循環(huán)3 次的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 9 Microstructure of SPI, SPI + M, radiated SPI and radiated SPI-M after 1, 2 and 3 freeze-thaw cycles

        3 結(jié) 論

        本實驗對輻照輔助接枝反應(yīng)制備的SPI乳液進行凍融特性研究,探究SPI質(zhì)量分數(shù)、m(SPI)∶m(M)、輻照劑量對改性產(chǎn)物的接枝度、褐變程度和乳析指數(shù)的影響。通過SDS-PAGE、出油率測定和光學顯微結(jié)構(gòu)觀察對改性產(chǎn)物進行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明,SPI-M最佳反應(yīng)參數(shù)為m(SPI)∶m(M)為4∶1、SPI質(zhì)量分數(shù)4%和輻照劑量7.5 kGy,輻照輔助接枝反應(yīng)不僅降低了糖的比例,還改善了凍融特性。SDS-PAGE結(jié)果表明SPI與麥芽糖發(fā)生接枝反應(yīng)。優(yōu)化的SPI-M樣品乳液經(jīng)過1、2、3 次凍融循環(huán)后出油率與SPI乳液相比分別降低了9.7%、21.2%和26.4%。微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果也證實了SPI-M樣品乳液比較穩(wěn)定。說明輻照作為一種冷加工技術(shù)協(xié)同接枝反應(yīng)改善蛋白乳液凍融特性是可行的。

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