黃家惠，王俊先，何 薇，徐德祥

外源化合物的暴露常會導(dǎo)致肝細胞死亡和肝臟功能障礙[1]。細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)急性暴露誘導(dǎo)的炎癥性肝損傷(acute liver injury，ALI)小鼠模型，能夠很好地模擬人類肝炎病毒入侵的病理生理過程[2]。ALI的發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前并未完全闡明，大量研究[3]表明炎癥和氧化應(yīng)激參與了肝臟的病理性損傷過程。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是一類核受體，是配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄因子[4]。羅格列酮(rosiglitazone, RSG)是噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，是臨床常用的2型糖尿病患者降糖藥物。研究[5]發(fā)現(xiàn)，補充RSG可以激活小鼠肝臟PPARγ核受體，通過抗感染和抗氧化作用拮抗對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)引起的藥物性肝損傷，然而補充RSG是否可以減輕LPS暴露引起的ALI目前還不清楚。因此該研究旨在探討補充RSG對LPS暴露誘發(fā)小鼠ALI的保護作用，并從抗感染和抗氧化作用部分探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 42只SPF級CD-1系成年雄鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，8周齡，體質(zhì)量28～30 g，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水，晝夜均衡。

1.1.2藥物與試劑 RSG購于成都恒瑞制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H20030569)；LPS購于美國Sigma公司(貨號067M4035V)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alaph, TNF-α) (貨號：CSB-E04741m)、巨噬細胞炎性蛋白-2 (macrophage inflammatory protein-2，MIP2) ELISA試劑盒(貨號：CSB-E04666m)購于武漢華美生物有限公司；p-c-fos (貨號：D82C12)、p-c-jun(貨號：D47G9)、NADPH氧化酶(NADPH-oxidase, NOX)-4(貨號：D21F6)、血紅素加氧酶 (haem oxygenase，HO) -1(貨號：E9H3A)和HO-2(貨號：D9J9U)一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；NOX-2(貨號：ab80508)和β-actin(貨號：ab179467)一抗購于美國Abcam公司。

1.1.3儀器 Senergy2多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Fine Do X6全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，Universal32R低溫高速離心機(德國Hettich科學(xué)儀器公司)；UV-1200型紫外可見分光光度計(上海翱藝有限公司)；CM1950組織冰凍切片機(德國萊卡公司)；XMTD-8222恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡和DP71成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2 動物模型的制備實驗動物隨機均分為6組：對照組(Control組)、保護劑組(RSG組)、LPS暴露6 h組(LPS 6 h組)、LPS暴露12 h組(LPS 12 h組)、RSG加LPS暴露6 h組(RSG+LPS 6 h組)和RSG加LPS暴露12 h組(RSG+LPS 12 h組)。除Control組和LPS組外，所有小鼠在LPS暴露前連續(xù)5 d給予RSG (10 mg/kg)灌胃處理，LPS組和RSG+LPS組小鼠給予LPS(2 mg/kg)單次腹腔注射構(gòu)建ALI小鼠模型，其余組給予等體積的生理鹽水，分別在LPS注射后6、12 h剖殺小鼠，留取小鼠血清和肝臟組織。

1.3 ALT、AST水平測定通過賴氏比色法測定小鼠血清ALT、AST水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.4 HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)改變?nèi)嶒瀯游锊糠指闻K組織，置于4%多聚甲醛溶液中，固定24 h后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色、中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟病理學(xué)改變并攝片，統(tǒng)計小鼠肝臟炎性細胞的數(shù)量。

1.5 ELISA檢測室溫平衡試劑盒，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣品稀釋液稀釋待測樣品，在酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，并留取空白孔，加入一抗工作液50 μl，封口膜蓋住，37 ℃水浴鍋中孵育3.5 h，加入300 μl洗滌液，重復(fù)洗板5次。加入酶標(biāo)抗體工作液，繼續(xù)37 ℃水浴鍋孵育2 h。重復(fù)洗板5次，加入底物工作液100 μl反應(yīng)30 min。然后加入反應(yīng)終止液，振蕩混勻，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，5 min內(nèi)完成檢測，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α和MIP-2的濃度。

1.6 肝臟總蛋白的提取與Western blot稱取40 mg肝臟組織到潔凈玻璃勻漿器中，加入0.5 ml含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上勻漿45次，勻漿完成后倒入1.5 ml EP管中，冰上靜置10 min，4 ℃離心機中9 160 r/min 離心15 min，吸取250 μl上清液，用BCA法檢測肝臟蛋白濃度，加入上樣緩沖液將所有樣品蛋白定至同一濃度，煮沸變性，分裝保存。固定玻璃卡槽，灌入所需濃度分離膠和濃縮膠，加入相同體積的蛋白樣品，開始電泳，然后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束，按照所需蛋白分子量大小剪去多余的膜，牛奶封閉，加入β-actin (1 ∶10 000)、p-c-fos (1 ∶2 000)、p-c-jun (1 ∶2 000)、NOX-4 (1 ∶2 000)、NOX-2 (1 ∶2 000)、HO-1 (1 ∶2 000)和HO-2 (1 ∶2 000)一抗，孵育結(jié)束繼續(xù)孵育不同二抗 (1 ∶80 000，羊抗兔和羊抗鼠)，加入ECL發(fā)光液分別檢測上述蛋白水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，所有定量數(shù)據(jù)符合正太分布的都以表示，每組實驗的樣本量都標(biāo)注在圖注中，兩組數(shù)據(jù)之間的差異性用t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSG減輕LPS誘發(fā)小鼠ALILPS暴露6 h和12 h后，小鼠肝臟重量無明顯變化，小鼠肝臟出現(xiàn)炎性細胞浸潤，肝臟炎性細胞滲出增多(圖1)；LPS注射后12 h，小鼠血清ALT和AST水平升高(P<0.01，t=3.819；P<0.01，t=5.474)(圖2)。而RSG預(yù)處理可減輕LPS暴露誘發(fā)的小鼠ALI，RSG+LPS組小鼠肝臟炎性細胞滲出數(shù)量減少(圖1)；此外，RSG+LPS組小鼠血清中ALT和AST水平降低(P<0.01，t=2.770；P<0.01，t=4.046)(圖2)。

2.2 RSG降低LPS暴露誘發(fā)小鼠血清炎癥因子的升高LPS注射后6 h上調(diào)小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α和趨化因子MIP-2的水平(P<0.01，t=-102.087；P<0.01，t=-31.593)(圖3)；而RSG預(yù)處理可降低LPS暴露誘發(fā)小鼠血清中TNF-α和MIP-2的升高(P<0.01，t=-6.818；P<0.01，t=-30.345)(圖3)。

2.3 RSG抑制LPS暴露激活小鼠肝臟AP-1信號LPS注射后6 h和12 h增加了小鼠肝臟c-fos蛋白磷酸化水平(P<0.01，t=-19.878；P<0.01，t=-4.872)(圖4A、B)，RSG預(yù)處理抑制了LPS所致的c-fos蛋白磷酸化水平 (P<0.01，t=-15.456；P<0.05，t=2.387)(圖4A、B)。同時也檢測了小鼠肝臟c-jun的蛋白磷酸化水平，顯示LPS暴露后6 h和12 h，C-Jun的蛋白磷酸化水平增強(P<0.01，t=-14.972；P<0.01，t=-18.687)(圖4A、C)，RSG預(yù)處理對LPS注射6 h后誘導(dǎo)的c-jun的蛋白磷酸化水平無明顯影響，但在12 h后c-jun的蛋白磷酸化水平被抑制(P>0.05，t=0.516；P<0.05，t=2.565)(圖4A、C)。

圖1 小鼠肝臟組織病理變化和炎性細胞數(shù) HE×400

A：小鼠肝臟HE染色；B：小鼠肝臟炎性細胞數(shù)；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；e：LPS 12 h組；f：RSG+LPS 12 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 6 h組比較：##P<0.01；與LPS 12 h組比較：△△P<0.01

圖2 小鼠血清ALT和AST的水平

A：小鼠血清ALT水平；B：小鼠血清AST水平；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 6 h組比較：##P<0.01

圖3 小鼠血清TNF-α和MIP-2的水平

A：小鼠血清TNF-α水平；B：小鼠血清MIP-2水平；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 6 h組比較：##P<0.01

2.4 RSG抑制LPS暴露上調(diào)小鼠肝臟NOXNOX的2個亞型，NOX-4和NOX-2蛋白表達在LPS注射后6 h無明顯改變，在12 h后分別升高了4.52倍(P<0.01，t=-29.299)(圖5A、B)和2.04倍(P<0.01，t=-12.26)(圖5A、C)；RSG預(yù)處理降低了LPS所致小鼠肝臟NOX-4蛋白表達升高(P<0.01，t=-12.046)(圖5A、B)，然而RSG預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的肝臟NOX-2蛋白表達升高無明顯影響(P>0.05，t=-0.128)(圖5A、C)。

2.5 RSG抑制LPS暴露上調(diào)小鼠肝臟抗氧化酶HO-1小鼠腹腔注射LPS 6 h和12 h后，小鼠肝臟抗氧化酶HO-1蛋白表達升高(P<0.01，t=-6.563；P<0.01，t=-7.985)(圖6A、B)，RSG預(yù)處理可以減輕LPS暴露引起的HO-1蛋白表達的升高(P<0.01，t=-14.972；P<0.05，t=3.143)(圖6A、B)。此外，檢測小鼠肝臟HO-2蛋白表達顯示，LPS暴露對小鼠肝臟HO-2蛋白表達無影響(圖6A、C)。

圖4 小鼠肝臟中c-fos和c-jun蛋白磷酸化水平

A：小鼠肝臟p-c-fos和p-c-jun；B：小鼠肝臟p-c-fos灰度分析；C：小鼠肝臟p-c-jun灰度分析；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；e：LPS 12 h組；f：RSG+LPS 12 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 6 h組比較：##P<0.01；與LPS 12 h組比較：△P<0.05

3 討論

LPS暴露誘導(dǎo)的小鼠炎癥性肝損傷模型旨在復(fù)制病毒性肝炎誘導(dǎo)的人類暴發(fā)性肝衰竭[6]。課題組采用腹腔注射LPS模擬ALI的病理過程，觀察了灌胃補充RSG對LPS誘發(fā)ALI的干預(yù)作用。顯示RSG預(yù)處理可減輕LPS暴露誘發(fā)小鼠肝臟炎性細胞滲出，降低LPS暴露引起的小鼠血清ALT和AST水平的升高。以上實驗結(jié)果表明RSG預(yù)處理可以減輕LPS暴露引起的小鼠ALI，然而具體的保護機制仍未清楚。

一項早期的研究[7]表明，炎癥信號參與了四氯化碳誘發(fā)的ALI，肝臟炎癥因子和趨化因子在ALI組中分泌明顯增加，炎性因子的釋放損傷了肝細胞膜和線粒體細胞膜，致使細胞通透型增加，導(dǎo)致了小鼠血液中ALT和AST的升高。AP-1信號通路是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)一系列的細胞進程，包括細胞增殖、存活和分化。AP-1是由Jun、Fos、Maf和ATF二聚體蛋白組成，c-jun和c-fos是2種最重要的AP-1轉(zhuǎn)錄因子組成原件。在炎癥情況下，AP-1信號被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位以后，可以啟動下游的促炎細胞介質(zhì)和細胞因子[8]，AP-1信號的激活參與了ALI的炎癥性病理進程[9]。本研究表明RSG預(yù)處理可以抑制LPS所致小鼠血清炎性因子和趨化因子的分泌以及小鼠肝臟c-jun和c-fos的磷酸化。以上實驗結(jié)果提示RSG預(yù)處理可能部分通過抑制AP-1信號降低炎癥水平，減輕LPS暴露引起的小鼠ALI。

圖5 小鼠肝臟中NOX-4和NOX-2蛋白表達水平

A：小鼠肝臟NOX-4和NOX-2蛋白表達；B：小鼠肝臟NOX-4灰度分析；C：小鼠肝臟NOX-2灰度分析；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；e：LPS 12 h組；f：RSG+LPS 12 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 12 h組比較：△△P<0.01

圖6 小鼠肝臟中HO-1和HO-2蛋白表達水平

A：肝臟HO-1和HO-2蛋白表達；B：肝臟HO-1蛋白表達灰度分析；C：肝臟HO-2蛋白表達灰度分析；a：Control組；b：RSG組；c：LPS 6 h組；d：RSG+LPS 6 h組；e：LPS 12 h組；f：RSG+LPS 12 h組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS 6 h組比較：##P<0.01；與LPS 12 h組比較：△P<0.05

大量的研究[10]表明氧化應(yīng)激在LPS所致的小鼠ALI中發(fā)揮著重要的作用，LPS暴露以后產(chǎn)生的過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)會損傷肝細胞，導(dǎo)致ALT和AST的升高。而越來越多的證據(jù)[11]表明，NOXs是促進產(chǎn)生超氧化物的呼吸鏈酶，NOXs可以促進ROS的產(chǎn)生。本課題組前期研究[5]已發(fā)現(xiàn)，RSG具有抗氧化作用，可以拮抗APAP暴露引起的藥物性肝損傷并抑制NOXs表達的上調(diào)。而本研究也顯示，LPS暴露以后，肝臟中NADPH氧化酶的2個主要亞型，NOX-2和NOX-4蛋白表達在LPS注射后12 h明顯增強。然而，RSG預(yù)處理可抑制LPS所致肝臟NOX-4表達的上調(diào)。以上研究結(jié)果提示，RSG預(yù)處理可能是通過抑制肝臟NOX-4的表達減輕LPS所致的ALI。

HO是催化血紅素生成CO、亞鐵離子和膽紅素的一種限速酶, 主要包括HO-1、HO-2和 HO-3。HO-1信號通路的激活通過加速分解代謝促氧化劑血紅素和氧自由基的分解代謝，保護機體免受氧化應(yīng)激損傷，是體內(nèi)最易被誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶。HO-1正常生理情況下表達較低，但是受到損傷或刺激時，如缺氧應(yīng)激、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素和重金屬等，HO-1的表達會升高[12]。有研究[13-14]支持HO-1可以抑制肝臟組織丙二醛的形成，降低脂質(zhì)過氧化，增加肝臟超氧化物歧化酶的生成，減輕氧化應(yīng)激損傷。有研究[5]表明，肝臟HO-1在APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷中被誘導(dǎo)并高表達。同時本課題也顯示LPS暴露以后，小鼠肝臟中HO-1蛋白表達明顯升高，RSG預(yù)處理可抑制LPS暴露引起的小鼠肝臟HO-1表達的升高。以上結(jié)果提示，RSG預(yù)處理可能是通過調(diào)節(jié)肝臟抗氧化酶HO-1減輕LPS所致小鼠ALI。

綜上所述，本課題研究了RSG預(yù)處理對LPS所致ALI過程中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響。研究結(jié)果顯示，RSG預(yù)處理可能部分通過抑制AP-1信號降低LPS所致促炎因子和趨化因子的分泌；RSG預(yù)處理可能部分通過調(diào)節(jié)NOX-4和抗氧化酶HO-1減輕LPS所致ALI。因此，RSG有可能被用于預(yù)防和治療LPS所致ALI。