李曼云，陶金輝，方 璇，馬 艷，潘顯陽(yáng)，厲小梅，李向培

痛風(fēng)是一種由高尿酸血癥和尿酸單鈉鹽(monosodium urate，MSU)晶體沉積引起的炎癥性疾病。目前有研究[1]表明，細(xì)胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的變化可激活嘌呤受體P2X配體門控離子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7R)信號(hào)通路，協(xié)同MSU晶體刺激產(chǎn)生核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3[oligomerization domain (NOD)-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3]炎癥小體并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 (Caspase-1)，使白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β分泌量增加，導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)作。因此，ATP的顯著變化是導(dǎo)致急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵。另外，臨床有部分高尿酸血癥患者一生從未發(fā)作痛風(fēng)，可能與P2X7R多態(tài)性相關(guān)。因此，P2X7R可能是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。人類P2RX7基因上存在許多單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)。既往有研究[2-3]報(bào)道，攜帶人P2RX7基因Arg 307>Gln突變體的細(xì)胞使P2X7R功能降低甚至缺失?，F(xiàn)擬探討在人急性白血病單核細(xì)胞株 (human leukemic monocyte,THP-1)源性巨噬細(xì)胞中，通過(guò)建立高尿酸鹽的背景，并分別轉(zhuǎn)染野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1細(xì)胞系，比較3種P2X7R功能的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人急性白血病單核細(xì)胞株THP-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；胎牛血清與RPMI-1640 培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-慢病毒載體(lentivirus，LVs)購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司；微量RNA提取試劑盒、 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及 SYBR?Green PCR試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；P2X7R、 IL-1β、NLRP3、 凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白含半胱氨酸天冬氨酸-1蛋白酶結(jié)構(gòu)域(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-1 recruitment domain，ASC)、Caspase-1及β-actin PCR引物均購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；IL-1β試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.2 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)，密切觀察THP-1細(xì)胞，培養(yǎng)期間每3 d更換1次培養(yǎng)基。

1.3 慢病毒搭載GFP熒光轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞并篩選目的基因取1×105個(gè)THP-1細(xì)胞，接種于48孔板培養(yǎng)，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。第2天細(xì)胞融合達(dá)40% ～50%，加入GFP-LVs，同時(shí)加入聚凝胺后搖勻，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后，熒光倒置顯微鏡DMI3000B(德國(guó) Leica公司)下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后再次傳代，并在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光是否衰減。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及功能實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染過(guò)的THP-1細(xì)胞先用丙二醇甲醚醋酸酯 (phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激3 h后，在野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型中各設(shè)置3組：MSU(M組)、MSU+ATP(MA組)、對(duì)照組(C組)，M組、MA組中加入MSU孵育6 h后， MA組中加入ATP孵育 1 h，分別收取3組中轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞上清液和細(xì)胞。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β各標(biāo)本細(xì)胞上清液凍存于-80 ℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)各標(biāo)本置于4 ℃緩慢解凍，1 000 r/min、4 ℃離心15 min，根據(jù)說(shuō)明書檢測(cè)上清液中IL-1β表達(dá)水平。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)溶液提取細(xì)胞總RNA，-80 ℃冰箱保存，最后集中進(jìn)行定量測(cè)定。使用ABI7500全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH 為內(nèi)參。反應(yīng)條件: 95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析: 溫度60～95 ℃ ，每個(gè)樣本重復(fù)3次，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用 ΔCt 和 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 在MSU背景下，突變體型Arg 307>Gln降低了ATP刺激P2X7R分泌IL-1β的能力MA組中野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1細(xì)胞上清液和細(xì)胞中IL-1β表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.606，P=0.035 2；F=9.063，P=0.001 14)；其中，與野生型相比，突變體型Arg 307>Gln上清液中IL-1β表達(dá)水平降低(P=0.016 4)(見(jiàn)圖1A)，細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)水平也降低(P<0.001)(見(jiàn)圖1B)。然而，野生型和突變體型Arg 307>Gln與空病毒型相比THP-1細(xì)胞上清液和細(xì)胞中IL-1β表達(dá)水平均基本無(wú)差異(上清液：P=0.120 8、P=0.597 2；細(xì)胞：P=0.119 9、P=0.226 1)。C組和M組的野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型上清液和細(xì)胞之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(上清液C組：F=0.891 5，P=0.458 1；上清液M組：F=2.375，P=0.138 9；細(xì)胞C組：F=4.794，P=0.057 0；細(xì)胞M組：F=1.399，P=0.301 2)。見(jiàn)圖1。

圖1 3種THP-1細(xì)胞上清液及細(xì)胞中IL-1β表達(dá)水平比較

A：上清液中IL-1β濃度; B：細(xì)胞中IL-1β mRNA；與野生型比較：*P<0.05,***P<0.001

2.2 在MSU背景下，突變體型Arg 307>Gln抑制了ATP刺激P2X7R對(duì)NLRP3的調(diào)控MA組中，野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.958；P=0.020 5)；其中，與野生型比較，突變體型中NLRP3 mRNA表達(dá)水平降低(P=0.027 9)。然而，野生型和突變體型Arg 307>Gln與空病毒型相比NLRP3 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085 9、P=0.491 5)。C組和M組中野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型之間NLRP3 mRNA的表達(dá)水平均亦無(wú)差異(分別是F=3.906，P=0.082 0；F=0.339 8，P=0.721 7)。見(jiàn)圖2。

圖2 3種THP-1細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 MSU背景下，野生型和突變體型Arg 307>Gln THP-1細(xì)胞中ASC表達(dá)均顯著增高，突變體型Arg 307>Gln不影響ATP刺激P2X7R對(duì)ASC的調(diào)控MA組中，野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1細(xì)胞中ASC mRNA的表達(dá)水平存在差異(F=14.22，P=0.005 3)，野生型和突變體型Arg 307>Gln組的ASC mRNA表達(dá)水平升高，但2組間ASC mRNA表達(dá)水平均無(wú)差異(P=0.169 4)。然而，野生型和突變體型Arg 307>Gln與空病毒型相比，ASC mRNA表達(dá)水平均存在差異(P=0.002 2、P=0.028 3)。C組和M組中野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型三者之間ASC mRNA的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.097，P=0.379 2；F=4.761，P=0.057 8)。

圖3 3種THP-1細(xì)胞中ASC mRNA表達(dá)水平比較

2.4 在MSU背景下，突變體型Arg 307>Gln THP-1細(xì)胞不影響ATP刺激P2X7R對(duì)Caspase-1的調(diào)控C組、M組和MA組中，野生型、突變體型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1細(xì)胞中Caspase-1 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.591 5，P=0.582 8；F=2.445，P=0.167 2；F=0.903 8，P=0.453 8)。

圖4 3種THP-1細(xì)胞中Caspase-1 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

痛風(fēng)作為一種自身炎癥性疾病， IL-1β在MSU誘導(dǎo)的炎癥通路中起著不可或缺的作用[4]。IL-1β的產(chǎn)生有3個(gè)步驟：IL-1β前體(pro-IL-1β)蛋白的產(chǎn)生；切割pro-IL-1β產(chǎn)生活性IL-1β蛋白；將IL-1β釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。其中， pro-IL-1β的處理，涉及到Caspase-1的激活，也是炎癥小體活化的基本特征。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與MSU晶體形成密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)[5]證明，在體內(nèi)MSU可被膜結(jié)合受體(如Toll樣受體，TLRs)和細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體(如NOD樣受體)識(shí)別。THP-1源性單核細(xì)胞在PMA的作用下分化為THP-1源性巨噬細(xì)胞并通過(guò)Toll 2樣受體(Toll-like receptor 2，TLR2)和TLR4識(shí)別MSU晶體破壞溶酶體，釋放到胞質(zhì)中的溶酶體組織蛋白酶B可結(jié)合NLRP3并激活NLRP3炎癥小體[6]。在NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)的作用中，NLRP3可以通過(guò)其富含亮氨酸的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(leucine rich repeat，LRR)識(shí)別并結(jié)合MSU晶體參與痛風(fēng)發(fā)病。目前認(rèn)為PMA通過(guò)激活NF-κB 通路誘導(dǎo) pro-IL-1β、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體(pro-caspase-1)的表達(dá)，在NLRP3炎癥小體的作用下使pro-caspase-1活化成為Caspase-1，促使 pro-IL-1β分化成為成熟IL-1β[7]。

既往Fettelschoss et al[8]用NLRP3激活劑即脂多糖刺激單核細(xì)胞系，后用ATP刺激。而Jhang et al[6]用PMA先刺激THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞系，再用MSU晶體激活下游信號(hào)通路，使IL-1β的分泌量顯著增加。研究[6]發(fā)現(xiàn)pro-IL-1β水平上調(diào)，但NLRP3炎癥小體和pro-caspase-1的表達(dá)水平不受影響。本研究中，使用ATP分別干預(yù)經(jīng)PMA誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)染過(guò)野生型、突變體型Arg 307> Gln和空病毒型的THP-1源性巨噬細(xì)胞，比較它們分泌IL-1β的能力以及ATP-P2X7R-IL-1β信號(hào)通路上3個(gè)因子的表達(dá)水平。在MSU晶體建立的高尿酸背景下，由ATP孵育的野生型THP-1細(xì)胞上清液IL-1β和細(xì)胞中IL-1β、NLRP3的mRNA表達(dá)水平均顯著高于突變體型。提示突變體型Arg 307> Gln可能影響了P2X7R功能，使ATP誘導(dǎo)的ATP-P2X7R-IL-1β通路分泌IL-1β的能力明顯降低，從而可能降低了炎癥的發(fā)生及痛風(fēng)的發(fā)作。

NLR家族包含2種炎癥小體，分別為NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)。當(dāng)識(shí)別特異性激動(dòng)劑后，NLRP3和AIM2可分別形成炎癥小體。而凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白含半胱氨酸天冬氨酸-1蛋白酶結(jié)構(gòu)域(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-1 recruitment domain ，ASC)是一種銜接NLRP3和AIM2的銜接蛋白，它們相互作用。一方面，ASC可募集pro-caspase-1到NLRP3炎癥小體復(fù)合物中，另一方面NLRP3和AIM2可誘導(dǎo)幾乎所有的ASC分子聚合，形成Caspase-1活化平臺(tái)—ASC斑點(diǎn)[9]，從而誘導(dǎo)了Caspase-1的活化和成熟[10]。在本研究中，當(dāng)MSU或ATP作為激動(dòng)劑作用于野生型和突變體型THP-1細(xì)胞時(shí)， MA組野生型ASC mRNA表達(dá)水平高于突變體型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)與ASC斑點(diǎn)形成后大部分被釋放到細(xì)胞外，相鄰巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用攝取ASC斑點(diǎn)導(dǎo)致部分ASC損失有關(guān)[10-11]。

近年來(lái)，Keller et al[12]提出Caspase-1可激活其他底物，調(diào)控大量細(xì)胞因子和應(yīng)激信號(hào)的分泌。Caspase-1還可以切割I(lǐng)L-1β的前體分子，使pro-IL-1β成為有活性成熟的IL-1β蛋白并在巨噬細(xì)胞中分泌出來(lái)[4]。由于Caspase-1可催化失活的酶原，通常在催化過(guò)程中自身被蛋白酶水解。本研究中， 各組Caspase-1蛋白的mRNA表達(dá)水平基本無(wú)差異，推測(cè)與其自身被蛋白酶水解有關(guān)[13]。