肖向陽，鄭德義，王寶云，李自力

長期愈合的軟組織傷口容易形成瘢痕，這不利于傷口愈合質(zhì)量[1]。因此，縮短軟組織創(chuàng)傷愈合時間，減少瘢痕形成，是臨床急需解決的問題。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)能分泌多種可溶性因子，如生長因子、細胞因子、胞外體等[2]。外泌體是一個40～100 nm大小的細胞外小泡，形成于胞質(zhì)并釋放到細胞外環(huán)境[3]。研究[4]表明ADSCs或其外泌體能夠促進真皮成纖維細胞在傷口愈合過程中的遷移，并且在促進皮膚或黏膜軟組織創(chuàng)傷修復中有積極作用。miRNAs在細胞增殖凋亡等各種細胞反應中具有重要要作用，研究[5]表明miR-34a在ADSCs作用中過表達能影響細胞周期及增殖，但在ADSCs外泌體干預人增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts，HSF)增殖凋亡情況中的作用尚不可知。因此該研究以HSF為研究對象，將其與過表達miR-34a的ADSCs外泌體共培養(yǎng)后，探討miR-34a在ADSCs外泌體影響HSF增殖、凋亡過程中的具體作用機制，以期為臨床研發(fā)新的治療瘢痕疙瘩的治療方案提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人脂肪組織來源于貴州省人民醫(yī)院整形外科的一名27歲進行吸脂術(shù)的健康女性，術(shù)前簽署知情同意書；HSF購自上海素冉生物科技有限公司；miR-34a過表達及其陽性對照慢病毒(2×108PFU/ml)購自上海漢恒生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；胰蛋白酶和膠原酶購自美國Gibco公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒以及蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR 試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Ⅰ型膠原蛋白(COL Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1和GAPDH抗體、兔抗人CD90、CD31、CD45、CD81、CD63、小鼠抗人CD105及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam公司；ExoQuick-TC外泌體沉淀液購自美國System Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1ADSCs的分離及鑒定 用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline，PBS)洗滌脂肪組織后，將脂肪組織切成約25～50 μm的片狀，用0.1%膠原酶在37 ℃下消化1 h，通過100 μm濾網(wǎng)過濾消化物，去除組織碎片獲得單細胞懸液。1 000 r/min 離心5 min分離含有ADSCs的細胞懸液，共離心6次。將ADSCs按5×107個/ml的濃度接種于培養(yǎng)瓶中。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，去除未貼壁細胞。每2 d換1次培養(yǎng)液，當細胞融合率達到80%后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。取第3代細胞上流式細胞儀檢測ADSCs表面分子標志物CD31、CD45、CD90、CD105的表達水平，并采用成骨誘導劑誘導分離出的ADSCs 成骨分化21 d，再使用茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察ADSCs成骨分化能力。

1.2.2細胞感染 取對數(shù)生長期ADSCs，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合度時，按照病毒感染比率值(MOI)50 ∶1分別加入miR-34a過表達慢病毒及其陰性對照慢病毒感染ADSCs，另取選用不做任何處理的ADSCs細胞作為對照，分別記為ADSCs/miR-34a組、ADSCs/miR-NC組和ADSCs組。培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后采用1 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達株。

1.2.3外泌體提取及鑒定 將ADSCs在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，加入胰蛋白酶消化后收集培養(yǎng)基，3 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，通過0.22 μm微孔過濾器。得到細胞上清液，再用微孔離心過濾裝置100 000 r/min離心2 h濃縮，然后用ExoQuick-TC外泌體沉淀溶液孵育過夜。PBS將得到的外泌體重懸后，BCA測定其濃度后置于-80 ℃?zhèn)溆?。透射電子顯微鏡觀察收集到的外泌體形態(tài)，通過Western blot法檢測外泌體標志物蛋白CD63和CD81的表達。根據(jù)不同分組ADSCs細胞提取的外泌體分為3組，分別為ADSCs外泌體(ExoADSCs)、ADSCs/miR-NC外泌體(ExoADSCs/miR-NC)和ADSCs/miR-34a外泌體(ExoADSCs/miR-34a)。

1.2.4外泌體與HSF細胞共培養(yǎng) 取對數(shù)生長期HSF細胞，以5×107個/孔的密度接種于6孔板中，血清饑餓培養(yǎng)24 h后，分為HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組，分別加入含有不同外泌體及等量PBS溶液的新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-34a的表達水平 采用TRIzol法提取各組ADSCs細胞及其外泌體總RNA，分光光度計測量RNA純度。采用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA，根據(jù)SYBR綠色熒光實時定量PCR試劑盒說明書，進行PCR檢測。其中所用引物為miR-34a：forward 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGAACAACCA-3′；reverse 5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAG TGTCTTAGCTG-3′；U6：forward 5′-CTCGCTTCGCAGCACA-3′；reverse 5′-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s(40個循環(huán))。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達。

1.2.6Western blot檢測外泌體標志蛋白的表達水平 采用不同外泌體處理HSF細胞48 h，棄培養(yǎng)基，收集各組細胞，采用RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后取上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。高溫變性后取25 μg蛋白上樣，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入一抗體兔抗人cleaved-Caspase-3(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、COL Ⅰ(1 ∶1 000)、COL Ⅲ(1 ∶1 000)、p-Smad2(1 ∶300)、p-Smad3(1 ∶2 000)、TGF-β1(1 ∶100)、CD81(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶結(jié)合二級抗體(1 ∶10 000)常溫孵育2 h，使用ECL化學發(fā)光法對蛋白質(zhì)進行化學發(fā)光，顯影和定影，將得到的膠片進行拍照后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶。

1.2.7MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期HSF細胞，以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置3個復孔。待細胞生長至70 %融合度時，采用不同外泌體處理的HSF細胞48 h，棄培養(yǎng)基，將10 μl MTT(0.5 mg/ml)加入各孔中孵育4 h，去除上清液，加入200 μl DMSO終止反應。將細胞在37 ℃下再培養(yǎng)15 min，使用Bio-Rad酶標儀在c490 nm波長處檢測每個孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期HSF細胞，以2×104個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合度時，采用不同外泌體處理HSF細胞48 h，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞后，胰酶消化并收集細胞，200 r/min離心5 min，棄上清液后重懸細胞，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(propidium lodide，PI)混勻，室溫避光孵育10 min，200 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml PBS重懸，立刻用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的鑒定流式細胞術(shù)結(jié)果(圖1A)顯示，ADSCs的表面抗原CD90、CD105呈陽性表達，而CD31、CD45呈陰性表達。將ADSCs進行成骨誘導后，茜素紅染色結(jié)果可見大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)(圖1B)，堿性磷酸酶染色結(jié)果可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色沉淀(圖1C)。說明，ADSCs分離成功。

2.2 ADSCs外泌體的鑒定經(jīng)透射電子顯微鏡掃描顯示，發(fā)現(xiàn)大部分呈雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形或橢圓形囊泡狀小體，直徑為50～100 nm(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與細胞溶解物比較，所提取物質(zhì)中外泌體特異性表達標志物CD63和CD81高表達(圖2B)。結(jié)果表明，所提取物質(zhì)為外泌體。

圖1 ADSCs的鑒定

圖2 ADSCs外泌體的鑒定

A：透射電鏡顯微鏡觀察ADSCs外泌體 Bar scale=100 nm，×140 000；B：Western blot法檢測ADSCs的細胞裂解物和外泌體中CD81和CD63蛋白的表達水平

2.3 慢病毒感染后ADSCs及其外泌體中miR-34a表達水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示，與ADSCs和ADSCs/miR-NC組比較，ADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=198.600，P<0.05)；與ExoADSCs和 ExoADSCs/miR-NC組比較，ExoADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=139.700，P<0.05)。見圖3。

1.市場主導原則。按照市場規(guī)律，在線上線下互動創(chuàng)新發(fā)展中發(fā)揮市場配置資源的基礎(chǔ)性作用，尊重企業(yè)的市場主體地位，并充分相信轄區(qū)企業(yè)和企業(yè)經(jīng)營者的智慧，尊重企業(yè)“+電子商務”的自主經(jīng)營權(quán)。

圖3 ADSCs與外泌體的miR-34a的表達水平

A：慢病毒感染ADSCs后miR-34a的表達水平；B：慢病毒感染ADSCs后，其外泌體中miR-34a的表達水平；1：ADSCs；2：ADSCs/miR-NC；3：ADSCs/miR-34a；a：ExoADSCs；b：ExoADSCs/miR-NC；c：ExoADSCs/miR-34a；與ADSCs或ADSCs/miR-NC組比較：*P<0.05；與ExoADSCs或ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

2.4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF增殖能力的影響MTT 24、48、72 h結(jié)果顯示，HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組細胞組間增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(F=108.721，P<0.05；F=206.433，P<0.05；F=213.148，P<0.05)；與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組HSF細胞增殖能力降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞增殖能力降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞增殖能力的影響

與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

2.5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡的影響如圖5、6所示，與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組 HSF細胞凋亡率升高，促凋亡蛋白cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較，HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞凋亡率升高，cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。

2.6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組HSF細胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較，HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05)，見圖7。

3 討論

脂肪組織廣泛分布于人體內(nèi)，在生理狀態(tài)下對鄰近的軟組織起著重要的支持和保護作用。同時，脂肪組織作為一種活躍的內(nèi)分泌器官，也是新陳代謝、生長發(fā)育、抗感染等生物學過程中的關(guān)鍵因素。自體脂肪移植用于復雜的傷口修復，在整形手術(shù)中也常用于軟組織再生，脂肪間充質(zhì)干細胞，在軟組織創(chuàng)傷修復中發(fā)揮著重要作用[6]。但其作用機制尚不清楚。目前加速愈合和減少瘢痕形成的傳統(tǒng)方法包括皮膚移植[7]、激光治療[8]和局部應用一些生長因子[9]。然而，這些方法可能導致萎縮性瘢痕、色素異常、皮膚壞死等不良后果[10]。此外，局部注射因子很容易被體液降解，并且其劑量和濃度在傷口處經(jīng)常發(fā)生較大的變化[11]。因此，有必要尋找一種穩(wěn)定、有效、安全的新方法來促進軟組織創(chuàng)面的愈合。

圖5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡的影響

A：HSF+PBS；B：HSF+ExoADSCs；C：HSF+ExoADSCs/miR-NC；D：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

圖6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

1：HSF+PBS；2：HSF+ExoADSCs；3：HSF+ExoADSCs/miR-NC；4：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

外泌體中miRNAs含量豐富且參與細胞大多數(shù)生理過程。miR-34a作為腫瘤抑制子，也對心肌成纖維化具有一定作用[14]。miR-34a是硬化成纖維細胞的潛在重要生物靶點，其通過調(diào)節(jié)Smad4促進TGF-β1誘導的心肌成纖維化細胞增殖、轉(zhuǎn)分化和膠原分泌[14]。但在皮膚的成纖維細胞中miR-34a的作用沒有相關(guān)研究報道。已有研究[15]證實抗凋亡蛋白Bcl-2是miR-34a的功能靶點，miR-34a通過與3’-UTR結(jié)合抑制Bcl-2的表達水平，進而促進腫瘤細胞凋亡。另外，miR-34a能抑制ADSCs的成骨成脂分化，并且降低了CDKs和Cyclins等多種細胞周期調(diào)控因子的表達，在細胞S期積累分裂細胞，抑制ADSCs的增殖[5]。這些研究報道從側(cè)面證明了miR-34a對ADSCs增殖凋亡以及細胞纖維化有一定的作用。本研究結(jié)果顯示，miR-34a過表達的ADSCs外泌體能有效抑制HSF的增殖，促進細胞凋亡，并且通過下調(diào)TGF-β/Smad、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達抑制HSF的纖維化和膠原合成來減少瘢痕的生成。從miRNAs水平闡述了ADSCs外泌體對瘢痕成纖維細胞的作用，對臨床上開發(fā)新的治療方案提供了有力的證據(jù)。

圖7 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

1：HSF+PBS；2：HSF+ExoADSCs；3：HSF+ExoADSCs/miR-NC；4：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05.