魏仕國,杜祥斌,焦衛(wèi)衛(wèi),李英奇

(山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

2018年全球有大約1 810萬癌癥新發(fā)病例和960萬癌癥死亡病例。其中，我國新增病例數(shù)占380.4萬例和死亡病例數(shù)占229.6萬例。相比于其他國家,我國癌癥發(fā)病率、死亡率全球第一[1]?；熓侵委煱┌Y的重要手段之一,雖然在臨床上取得了一定成效,但是其潛在毒副作用等缺陷影響了它們的治療效果,限制了它們的廣泛使用[2-3]。目前已有80多種化療藥物已被用于臨床治療,如甲氨蝶呤[4]、喜樹堿[5]和鹽酸多柔比星[6]。其中俗稱阿霉素(DOX)的鹽酸多柔比星,是最常用的抗癌藥物之一[7],臨床上一般采用靜脈注射的方式進(jìn)行給藥,經(jīng)過血液循環(huán)系統(tǒng)運輸?shù)侥[瘤組織,但是由于DOX具有非特異性,所以在運輸過程中也會在心、肝、肺等臟器和其他正常組織有所累積而殺死正常細(xì)胞,進(jìn)而引起心臟毒性、腎臟毒性、骨髓抑制等,表現(xiàn)出惡心、脫發(fā)、食欲不振等不良反應(yīng)[8-11],很大程度上影響了患者的生活質(zhì)量和治療效果。因此,通過藥物的可控輸送可提高藥物利用率并克服游離DOX高毒副作用的缺點。

近年來,隨著納米技術(shù)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展,一些具有特定功能的納米粒子不斷被研制出來,并且在疾病診斷及治療方面得到廣泛的應(yīng)用[12-15]。其中,納米鉆石(ND)因為具有比表面積大、生物相容性好、吸附性強、低毒副作用和表面易修飾等優(yōu)點[16-19],成為科研工作者在納米領(lǐng)域中的研究熱點。例如,中科院黃青教授課題組運用MTT實驗探究了單壁碳納米管、多壁碳納米管、炭黑和ND的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)ND基本上沒有毒性[20]。并且,美國西北大學(xué)Dean教授課題組[21-22]比較了不同尺寸的ND負(fù)載不同藥物的治療效果,發(fā)現(xiàn)ND藥物體系能在腫瘤部位釋放游離藥物。

但是ND在溶液中的較大聚集趨勢[23],阻礙其在藥物輸送方面的應(yīng)用。為了克服這一缺陷,往往引入一些蛋白質(zhì)或聚合物對ND進(jìn)行表面改性以提高其分散性。利用PEG修飾納米顆粒后,不僅可以避免其被免疫系統(tǒng)迅速識別清除,而且能延長有效成分在體內(nèi)停留的時間[24-27],并且我們發(fā)現(xiàn)PEG化的納米鉆石(粒徑約140 nm)的分散性和穩(wěn)定性明顯提高,并使載藥量顯著上升[28]。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

試劑:納米鉆石(ND,50 nm,河南省豫星華晶微鉆有限公司),按文獻(xiàn)[30]處理成羧基化的納米鉆石,供實驗備用;N-羥基丁二酰胺(NHS,Sigma,USA);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸(EDC,Sigma,USA);2-(N-嗎啡代)乙磺(MES,北京索萊寶科技有限公司);聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,上海西寶生物科技有限公司);人肝癌細(xì)胞(HepG2,山西大學(xué)分子科學(xué)研究所);高糖液體培養(yǎng)基(DMEM,賽默飛世爾生物化學(xué)品有限公司);胰酶細(xì)胞消化液(北京索萊寶科技有限公司);熒光染料(H33258,Sigma,USA);0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和0.01 mol/L硼酸鹽緩沖溶液(BBS)由實驗室配置;實驗用水為二次蒸餾水;其他試劑均為分析純。

儀器:馬爾文粒度儀(英國Nano ZS90);真空干燥箱(上海一恒科技儀器有限公司);冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);自動聚焦耦合單模微波儀(Discover SP,美國CEM公司);數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);微量高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京亞泰科隆實驗科技公司);超凈工作臺(上海力申科學(xué)儀器有限公司);熒光顯微鏡(德國卡爾蔡司公司);紫外-可見光分光光度計(北京普析通用公司);傅立葉變換紅外光譜儀(BRUKER)。

1.2 鹽效應(yīng)對ND物理吸附DOX的影響

稱取適量的Na3Cit、NaHCO3、NaAc、NaCl、KCl、K2C2O4、Na2SO4和NaH2PO4固體,用去離子水分別配制1 mol/L溶液。用微量加樣器各量取上述溶液1 mL,各加入0.5 mg 羧基化的ND,超聲分散30 min形成懸濁液,接著分別加入50 μL(2 mg/mL)的DOX,用微波儀處理,設(shè)置微波儀溫度為25℃,反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,將產(chǎn)物洗滌離心直至上清液無色,收集上清液。DOX的濃度由480 nm處的吸光度值確定(DOXε480 nm=11 500 cm-1·mol-1·L-1),通過測定DOX的吸光度值,計算出加入DOX的總質(zhì)量和上清液中DOX的總質(zhì)量,從而得知ND表面負(fù)載DOX的量。

1.3 ND-PEG/DOX的制備和DOX吸附量的測定

首先根據(jù)我們先前方法[30],獲得了PEG化的納米鉆石(ND-PEG)。接著將1 mg ND-PEG加入到1 mL(1 mol/L)的Na3Cit、NaHCO3、NaAc或NaH2PO4陰離子介質(zhì)中,超聲分散1 h后,加入100 μL(2 mg/mL)DOX,用微波儀處理,設(shè)置微波儀溫度為25℃,反應(yīng)1.5 h。待反應(yīng)結(jié)束,將產(chǎn)物ND-PEG/DOX洗滌離心至上清液無色,收集上清液。根據(jù)上述方法確定負(fù)載到ND-PEG載體上DOX的量。

1.4 pH對ND-PEG負(fù)載DOX的影響

用1 mol/L HCl和NaOH溶液在pH計上分別配置pH=3.45、5.55、6.52、8.22、9.17、10.42和11.40的系列水溶液,分別配置2 mL(100 μg/mL)DOX溶液,取配好溶液1 mL,加入0.5 mg ND-PEG,超聲分散30 min。用微波儀處理,設(shè)置微波儀溫度為25℃,反應(yīng)1.5 h。離心洗滌,收集上清液,計算出ND-PEG負(fù)載DOX的吸附量。

1.5 納米材料的表征

1.5.1 納米材料的紫外-可見吸收光譜

以Na3Cit為介質(zhì),獲得ND-PEG/DOX載藥體系。將ND、ND-PEG、ND-PEG/DOX、DOX和Na3Cit配為一系列懸濁液或溶液,并且在測試前將納米材料置于去離子水中,超聲分散均勻。對比它們的紫外-可見吸收光譜,從而得到納米載體上是否負(fù)載抗癌藥物DOX。

1.5.2 納米材料的紅外吸收光譜

在Na3Cit中制備ND-PEG/DOX后,取適量干燥的DOX、ND、ND-PEG、ND-PEG/DOX和Na3Cit等 5個樣品分別與KBr粉末混勻并研磨、壓片,用紅外光譜儀對樣品分別進(jìn)行掃描,掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.5.3 納米材料的表面Zeta電位

在Na3Cit中制備ND-PEG/DOX后,將適量的ND、ND-PEG、ND-PEG/DOX在去離子水中超聲均勻分散,通過馬爾文粒度儀測其表面Zeta電位值。

1.6 納米藥物體外釋藥

分別以NaAc、NaHCO3和Na3Cit為反應(yīng)介質(zhì),制備ND-PEG/DOX/NaAc、ND-PEG/DOX/NaHCO3、ND-PEG/DOX/Na3Cit,并采用透析法進(jìn)行體外釋藥。先稱取等量的兩組納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc、ND-PEG/DOX/NaHCO3和ND-PEG/DOX/Na3Cit,一組各加入1.0 mL pH 5.0 PBS緩沖溶液中,另一組各加入1.0 mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中,超聲分散30 min后將其加入透析袋中,透析袋兩端封口,浸泡入裝有9.0 mL PBS緩沖溶液的50 mL離心管中。置于臺式恒溫振蕩器中(參數(shù)設(shè)定為溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min)并避光,設(shè)定不同時間間隔,從離心管中取出2.0 mL透析液,并加入2.0 mL新的PBS緩沖溶液,隨后于紫外-可見分光光度計測定DOX在480 nm處的吸光度,利用DOXε480 nm=11 500 cm-1·mol-1·L-1計算出DOX的含量,并繪制藥物累積釋放曲線。

1.7 ND-PEG/DOX的細(xì)胞形態(tài)觀察

將1 mL的HepG2(1.5×105個細(xì)胞/mL)移植于5個35 mm培養(yǎng)皿中,放在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)15 h,等細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后,選擇未作任何處理的細(xì)胞為參照。分別將DOX(5 μg/mL)、ND-PEG/DOX/Na3Cit(5 μg/mL DOX)、ND-PEG/DOX/NaHCO3(5 μg/mL DOX)和ND-PEG/DOX/NaAc (5 μg/mL DOX)與HepG2細(xì)胞孵育24 h后,吸除培養(yǎng)液,用PBS(pH 7.4)洗細(xì)胞3遍后用4%的多聚甲醛固定,再用PBS(pH 7.4)洗3遍后用H33258染核,最后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 MTT比色法檢測細(xì)胞毒性

將HepG2按一定密度以每孔200 μL移植于2個96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中,放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h。待細(xì)胞完全貼壁后選取每個板中間10列細(xì)胞,每列6孔,記10組。選取其中1個板的1列為參照組,在其余9列中依次加入0.005、0.01、0.05、0.5、1、3、5、7、9 μg/mL DOX;另一個板中加入ND-PEG/DOX/Na3Cit,負(fù)載的DOX濃度與第1個板相同。分別與細(xì)胞孵育48 h和72 h。接著在每孔中加入20 μL(5 mg/mL)MTT,孵育5 h,棄培養(yǎng)液,再把150 μL 的二甲基亞砜(DMSO)依次加入到孔中。震蕩一段時間后,在酶標(biāo)儀中設(shè)定波長為490 nm,測每孔試樣的吸光度值A(chǔ),計算每組實驗的平均吸光度值。接著根據(jù)公式:

求每組細(xì)胞的存活率。

2 實驗結(jié)果

2.1 ND-PEG的鹽效應(yīng)和pH效應(yīng)

當(dāng)Na3Cit、NaHCO3、NaAc、 NaCl、KCl、K2C2O4、Na2SO4和NaH2PO4分別作為ND吸附DOX反應(yīng)的介質(zhì)時,由圖1A可知,這些介質(zhì)中負(fù)載阿霉素的量遠(yuǎn)高于去離子水介質(zhì)中負(fù)載的量。此外,在Na3Cit、NaHCO3、NaAc、K2C2O4和NaH2PO4五種反應(yīng)介質(zhì)中,ND對DOX的負(fù)載量較高。

圖1 不同介質(zhì)中ND或ND-PEG對DOX的載藥量

由于ND在溶液中的分散性較差[20],所以阻礙了它在藥物輸送方面的應(yīng)用。而PEG修飾納米顆粒后,不僅可以避免其被免疫系統(tǒng)迅速識別清除,而且能延長有效成分在體內(nèi)停留的時間[24-27]。為了提高ND的分散性,采用PEG對其進(jìn)行表面改性。分別以促進(jìn)ND對DOX負(fù)載效果較明顯的NaAc、NaH2PO4、K2C2O4、 NaHCO3或Na3Cit為反應(yīng)介質(zhì),探究不同介質(zhì)中ND-PEG對DOX負(fù)載量的差異(如圖1B)。因DOX的pKa等于8.3[29],濃度為1 mol/L的NaAc、NaHCO3、Na3Cit、K2C2O4、NaH2PO4溶液的pH值分別是9.83、8.31、8.65、8.01和3.88,DOX在前三者中的存在形式為-NH2,且ND-PEG納米顆粒表面富含羧基,所以DOX的-NH2和ND-PEG納米顆粒表面的羧基(-COO-)能通過分子間氫鍵作用力和范德華力連接,另外DOX之間的π-π堆積也可以使DOX負(fù)載于ND-PEG表面,從而得到DOX負(fù)載量較大的納米藥物體系ND-PEG/DOX。而DOX在NaH2PO4和K2C2O4(1 mol/L)中的存在形式為-NH3+,在NaH2PO4介質(zhì)中,DOX的-NH3+和ND-PEG表面的羧基(-COOH)之間主要依靠范德華力;而K2C2O4介質(zhì)中,DOX的-NH3+和ND-PEG表面的羧基(-COO-)之間主要依靠靜電引力結(jié)合,因此在NaH2PO4和K2C2O4(1 mol/L)介質(zhì)中藥物負(fù)載量相對前三者較低。如圖1B所示,反應(yīng)介質(zhì)影響ND-PEG對DOX載藥量的大小順序為NaAc>NaHCO3>Na3Cit>K2C2O4>NaH2PO4,載藥量分別是226.45 μg/mg、140.43 μg/mg、125.24 μg/mg、87.55 μg/mg和57.33 μg/mg。此外,pH對ND-PEG吸附DOX的影響如圖1C所示,在偏堿性(pH=8～10)溶液中,ND-PEG對DOX的負(fù)載量較多,且載藥量基本保持不變。結(jié)合圖1B和圖1C,可以得出,當(dāng)pH=8～10時,ND-PEG對DOX載藥量主要受鹽效應(yīng)的影響。

2.2 納米材料的表征

2.2.1 納米材料的紫外-可見吸收光譜

由圖2插圖可以明顯觀察到,ND-PEG/DOX體系明顯顯示DOX的顏色,表明ND-PEG/DOX體系存在有DOX,進(jìn)一步用紫外-可見吸收光譜對ND-PEG/DOX進(jìn)行表征,結(jié)果如圖2所示。對照游離DOX的紫外-可見吸收光譜圖,發(fā)現(xiàn)納米藥物體系的紫外-可見吸收光譜出現(xiàn)了DOX的特征吸收峰,而ND和ND-PEG并沒有DOX的特征吸收峰,說明ND-PEG納米顆粒負(fù)載上了抗癌藥物DOX。

圖2 不同納米材料的紫外-可見吸收光譜(插圖:ND-PEG/DOX懸濁液(左)和ND懸濁液(右))

2.2.2 納米材料的紅外光譜

不同物質(zhì)的紅外光譜(FTIR)圖如圖3所示。在ND的紅外光譜圖中,3 422 cm-1處所對應(yīng)的吸收峰為-OH的伸縮振動峰,在1 765 cm-1處是-C=O的伸縮振動,1 100 cm-1處為-C-O的伸縮振動，證明ND表面存在大量-COOH;比較ND的FTIR光譜圖,在ND-PEG的光譜中,2 919 cm-1處的吸收帶歸因于PEG內(nèi)的-CH2基團(tuán),與此同時,1 790 cm-1、1 633 cm-1和1 261 cm-1處的吸收峰,對應(yīng)于C=O伸縮振動、N-H彎曲振動和酰胺鍵的C-N伸縮振動,均表明PEG結(jié)合在ND的表面。在ND-PEG/DOX中,1 411 cm-1處的吸收帶是DOX苯環(huán)骨架振動,1 580 cm-1代表DOX中苯環(huán)的C=C伸縮振動也與DOX的FTIR譜圖保持一致。這些結(jié)果表明DOX成功地附著在ND-PEG表面。

圖3 不同納米材料的紅外光譜圖

2.2.3 納米材料的Zeta電位

圖4 不同納米材料的Zeta變化圖

2.3 ND-PEG/DOX納米藥物體外釋藥

一個良好的藥物輸送體系應(yīng)該具有藥物可持續(xù)釋放和腫瘤部位專一釋放的特性。如果在生理血液循環(huán)環(huán)境釋放,將引起正常組織受損導(dǎo)致毒副作用。眾所周知,人體各部位pH各有差異,例如腫瘤組織(pH～6.5)和腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體和核內(nèi)體(pH 4.5～5.5)為弱酸性環(huán)境,正常組織卻為中性環(huán)境(pH～7.4)[31-32],因此利用pH的不同,可以設(shè)計藥物輸送體系在腫瘤部位釋放藥物,在正常組織不釋放,進(jìn)而降低其毒副作用。為了探究納米藥物ND-PEG/DOX是否具備該特性,分別以制備的ND-PEG/DOX/NaAc、ND-PEG/DOX/NaHCO3和ND-PEG/DOX/Na3Cit為釋藥體系。此外,我們已發(fā)現(xiàn)納米鉆石載藥體系進(jìn)入腫瘤細(xì)胞主要位于溶酶體[28,33],因此,利用透析袋法,體外模擬人體腫瘤細(xì)胞溶酶體環(huán)境(pH 5.0)和正常生理環(huán)境(pH 7.4)研究了ND-PEG/DOX的釋藥行為。由圖5可知,當(dāng)pH為5.0時,經(jīng)過70 h,ND-PEG/DOX/NaAc、ND-PEG/DOX/NaHCO3和ND-PEG/DOX/Na3Cit的DOX的累積釋藥率分別為16.59%、32.15%和34.83%,ND-PEG/DOX/Na3Cit的釋藥率最大。而在pH 7.4的條件下,ND-PEG/DOX的累積釋藥率均<2.2%。ND-PEG/DOX在酸性環(huán)境中藥物釋放明顯增加,可能是因為DOX與ND-PEG/DOX間的氫鍵受到H+破壞,從而使DOX從ND-PEG/DOX解離釋放。可見ND-PEG/DOX在藥物可控釋放中具有潛在應(yīng)用。

圖5 不同介質(zhì)中合成的ND-PEG/DOX在不同pH中的體外藥物釋放曲線

2.4 ND-PEG/DOX納米藥物體系的細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞毒性

2.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

為了證明納米藥物體系能夠?qū)崿F(xiàn)有效癌癥治療,我們通過細(xì)胞形態(tài)研究了該體系對細(xì)胞的毒性效果,結(jié)果如圖6所示。由圖可知,ND-PEG/DOX與HepG2細(xì)胞作用24 h后,空白組細(xì)胞生長良好,形狀規(guī)則,而納米藥物組和DOX組細(xì)胞明顯受到影響,導(dǎo)致細(xì)胞褶皺,形狀模糊,數(shù)量減少,碎片增加。對比空白組細(xì)胞組,納米藥物體系殺死癌細(xì)胞效果明顯,且殺死癌細(xì)胞順序為ND-PEG/DOX/Na3Cit>ND-PEG/DOX/NaHCO3>ND-PEG/DOX/NaAc,可能與三者釋藥量有關(guān)。

2.4.2 細(xì)胞毒性實驗

由圖5和圖6可知,ND-PEG/DOX/Na3Cit體系釋藥率最大和殺死腫瘤細(xì)胞效果最好,推測該體系藥物利用率最大,因此用MTT實驗探究了ND-PEG/DOX/Na3Cit體系的細(xì)胞毒性。從圖7可以看出,對比空白組細(xì)胞,DOX和ND-PEG/DOX與HepG2細(xì)胞作用了72 h和48 h后,都抑制了其活性,并且隨著濃度的增加,抑制效果越明顯。經(jīng)計算獲得DOX半抑制濃度IC50在48 h和72 h分別為0.21 μg/mL 和0.20 μg/mL, 兩者基本一致。而ND-PEG/DOX的72 h的IC50大于48 h的IC50值,分別為2.79 μg/mL和1.08 μg/mL,所以同濃度下的抑制程度大小為DOX>ND-PEG/DOX,然而伴隨濃度的升高,ND-PEG/DOX的抑制能力接近游離藥物DOX。這是由于納米鉆石藥物體系進(jìn)入細(xì)胞后,在一定條件下才能釋放DOX,而后遷移進(jìn)細(xì)胞核殺死腫瘤細(xì)胞[34-35],而游離藥物DOX通過被動擴散進(jìn)入細(xì)胞, 遷移進(jìn)細(xì)胞核的速率要大于ND-PEG/DOX體系,所以ND-PEG/DOX體系具有緩釋藥物效果。

圖6 不同納米材料與腫瘤細(xì)胞作用24 h的細(xì)胞形態(tài)

圖7 ND-PEG-DOX/Na3Cit以及游離藥物DOX作用不同時間對HepG2細(xì)胞活性的影響;(A)48 h;(B)72 h

3 結(jié)論

本文以粒徑大小為50 nm 的納米鉆石(ND)為原材料,先通過化學(xué)鍵將H2N-PEG-COOH連接到ND表面得到分散良好的ND-PEG納米顆粒,通過陰離子調(diào)控將DOX以物理吸附方式負(fù)載到ND-PEG表面,獲得了一種新型的高載藥量的納米藥物體系ND-PEG/DOX。采用紫外-可見吸收光譜、傅立葉紅外光譜(FTIR)及Zeta電位表征,表明納米鉆石藥物體系成功制得。并且通過紫外-可見分光光度法測得,以Na3Cit為介質(zhì)制備的ND-PEG/DOX納米藥物體系的DOX的偶聯(lián)量為125.24 μg/mg。同時探究了在不同介質(zhì)中制備的ND-PEG/DOX的體外釋藥情況,發(fā)現(xiàn)納米藥物體系酸性條件下釋放較多游離的DOX,ND-PEG/DOX/Na3Cit釋藥率最大,而正常生理條件下釋藥較少,這樣降低了藥物的損失和對正常組織的毒性,在抑制腫瘤增長的同時可以有效降低化療藥物的毒副作用。通過與人肝癌細(xì)胞(HepG2)作用,ND-PEG/DOX納米顆粒能有效殺死癌細(xì)胞,且具有緩釋效果。