范海霞 趙颯 辛國奇 李靜

（1. 許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，許昌 461000；2. 許昌市林業(yè)科學(xué)研究所，許昌 461000）

干旱脅迫是限制植物正常生長發(fā)育，造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低的重要環(huán)境因素之一［1］。伴隨著全球氣候變化，未來世界范圍內(nèi)干旱發(fā)生的頻次和強(qiáng)度均會(huì)增加，干旱及半干旱地區(qū)作物生長受到的威脅日趨嚴(yán)重［2］。因此，如何應(yīng)對(duì)水資源短缺造成的植物生長受限，逐漸成為植物研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致植物根系細(xì)胞對(duì)水分的吸收受阻，影響植物細(xì)胞內(nèi)生理和生化反應(yīng)正常進(jìn)行，造成植物生長矮小、干物質(zhì)積累量降低等后果［3］。此外，干旱脅迫下植物葉片光合色素發(fā)生降解、氣孔關(guān)閉、光化學(xué)活性受到抑制等，致使葉片光合作用進(jìn)程受到影響［4］。干旱脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等高反應(yīng)活性的自由基過度積累，通過氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等途徑破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，同時(shí)植物依賴一套以超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）等酶為代表的抗氧化酶系統(tǒng)協(xié)調(diào)緩解其過氧化傷害［5-6］。干旱脅迫下，植物自身還可以通過改變其新陳代謝過程，提高并積累脯氨酸、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以促進(jìn)植物細(xì)胞對(duì)水分的攝取能力，從而應(yīng)對(duì)干旱脅迫影響［7］。

研究表明，外源物質(zhì)尤其是植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用是提高作物抗旱性的有效途徑［8］。褪黑激素（Melatonine，MT），又名N-乙?；?5-甲氧基色胺，是一種重要的外源性植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物種子生根發(fā)芽、促進(jìn)營養(yǎng)和生殖生長等關(guān)鍵生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。眾多研究表明，褪黑素能夠提高植物對(duì)鹽堿、干旱、重金屬、高溫、紫外線輻射等多種脅迫的抵抗能力［11-14］。研究發(fā)現(xiàn)，MT可作為一種抗氧化劑，增強(qiáng)逆境脅迫下植物抗氧化防御系統(tǒng)并降低脂質(zhì)過氧化和過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）水平，從而提高植物的抗逆性［15］。Dong等［16］研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理能夠有效延緩干旱脅迫造成的奇異果葉片衰老。史中飛等［17］研究了外源褪黑素對(duì)油菜幼苗抗寒性的影響，結(jié)果表明，施用外源褪黑素能顯著增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)活性、降低脂質(zhì)過氧化水平從而增強(qiáng)油菜幼苗對(duì)低溫的適應(yīng)性。也有研究指出，相對(duì)于未經(jīng)外源褪黑素處理的植物而言，經(jīng)外源褪黑素處理后植物糖代謝和光合作用速率得到大幅提高，從而有效提高了逆境脅迫下植物生長速率［18］。此外，在對(duì)辣椒［19］、向日葵［20］、小麥［21］、煙草［22］等方面的研究也表明外源褪黑素能有效緩解干旱脅迫對(duì)植物生長的抑制作用。

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）屬芍藥科芍藥屬牡丹組，是我國的傳統(tǒng)名花，素有“花王”之稱［23］。牡丹因其花大色艷，在園林綠化、觀賞花卉等領(lǐng)域有重要價(jià)值。在國內(nèi)，牡丹種植主要分布在干旱及半干旱地區(qū)，而相對(duì)缺水的環(huán)境致使牡丹生長發(fā)育受到限制，其觀賞價(jià)值也大打折扣［24］。褪黑素在提高植物抗旱性方面發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于褪黑素在牡丹上應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道，褪黑素能否提高牡丹抗旱性及作用機(jī)制尚不清楚，關(guān)于褪黑素施用濃度的具體效應(yīng)亦不明確。

本研究以牡丹品種鳳丹（Paeonia ostiiFengdan）幼苗為試材，采用營養(yǎng)液水培法研究外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗生長及生理特性的影響，探討褪黑素提高牡丹幼苗耐旱性的機(jī)制，以期為牡丹栽培種植及推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用牡丹品種為鳳丹（P.ostiiFengdan）一年生幼苗，種子由洛陽國際牡丹園提供。褪黑素購自購自Sigma公司，以PEG-6000（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）模擬干旱脅迫環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2018年8月在許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)進(jìn)行。挑選優(yōu)質(zhì)飽滿種子，采用直接沙藏促牡丹種子生根發(fā)芽。后移植于營養(yǎng)缽中培育，栽培基質(zhì)為泥炭∶蛭石∶河砂=3∶1∶1（V∶V∶V）。幼苗于溫室常規(guī)栽培管理至復(fù)葉第三葉成熟，移栽至人工氣候培養(yǎng)箱（RXZ-380B，寧波江南）用全Hoagland營養(yǎng)液水培培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為晝（14h/25℃）、夜（10 h/20℃），光照強(qiáng)度3 000 lx，60%相對(duì)濕度。還苗5 d后選取長勢一致的健康植株開始試驗(yàn)處理。

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以混合0.1 kg/L的PEG-6000的全Hoagland營養(yǎng)液模擬干旱脅迫，共設(shè)置5個(gè)處理：（1）CK：0 kg/L PEG+0 μmol/L MT ；（2）D ：0.1 kg/L PEG+0 μmol/L MT ；（3）MT1：0.1 kg/L PEG+50 μmol/L MT ；（4）MT2：0.1 kg/L PEG+100 μmol/L MT ；（5）MT3 ：0.1 kg/L PEG+200 μmol/L MT。每個(gè)處理重復(fù)5次，每個(gè)重復(fù)10株。還苗5 d結(jié)束后開始噴施不同濃度外源MT，對(duì)照以蒸餾水代替，連續(xù)預(yù)處理3 d。隨后將幼苗置于不同干旱脅迫處理營養(yǎng)液中，干旱處理5 d后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.2.2 測定指標(biāo)和方法

1.2.2.1 生長指標(biāo) 幼苗用蒸餾水沖洗干凈后，將莖葉和根系分開，置于105℃蒸30 min，后在80℃潔凈烘箱烘干至恒重，使用精密天平稱量其干物質(zhì)量。

1.2.2.2 葉片光合色素含量 參照王學(xué)奎等［25］方法，采用95%乙醇提取測定葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。使用分光光度計(jì)在波長665、649和470 nm下測定吸光度。

1.2.2.3 葉片光合及熒光參數(shù) 使用便攜式光合測定系統(tǒng)（LI-6400XT，美國LI-COR）測定葉片凈光合速率（Photosynthetic，Pn）、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance，Gs）、 蒸 騰 速 率（Transpiration rate，Tr）和胞間CO2濃度（Intercellular CO2concentration，Ci）等光合作用參數(shù)，測定光照強(qiáng)度為1 200 μmol/m2·s，CO2濃度為 390 μmol/mol。使用便攜式熒光測定儀（PAM-2100，德國Walz）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括暗適應(yīng)葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)換效率（Fv'/Fm'）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、實(shí)際PSⅡ光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）、葉綠素?zé)晒夤饣瘜W(xué)猝滅系數(shù)（qP）及非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）。

1.2.2.4 葉片生理指標(biāo) 參照李合生等［26］方法，采用硫代巴比妥酸法（Thiobarbituric acid，TBA）測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量；參照林植芳等［27］方法，測定葉片H2O2含量；參照楊璐等［28］方法，采用羥胺氧化法測定葉片O2-含量；參照Nayyar等［29］方法，測定葉片膜質(zhì)傷害指數(shù)（Membrane injure index，MII），計(jì)算公式為MII（%）=（EC1/EC2）×100，其中 EC1為 25℃2500，EC2為100℃1000。

參照王學(xué)奎等［25］方法，采用氮藍(lán)四唑還原法測定SOD活性；采用紫外吸收法測定CAT活性；APX及谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）活性測定參照 Constán-Aguilar等［30］方法測定 ；參照李合生等［26］方法，可溶性蛋白的含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測定；可溶性總糖的含量采用蒽酮比色法進(jìn)行測定；脯氨酸的含量采用酸性茚三酮法進(jìn)行測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析 采用Excel 2010和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 9.0進(jìn)行分析繪圖，每處理重復(fù)5次，對(duì)平均數(shù)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗植株生長的影響

如圖1所示，與對(duì)照相比，干旱脅迫處理?xiàng)l件下，牡丹幼苗莖葉、根系和總干重均顯著降低，降幅分別達(dá)42.19%、28.50%和41.01%，說明干旱脅迫限制了牡丹幼苗的生長。不同濃度外源MT處理后牡丹幼苗植株干物質(zhì)量較干旱脅迫處理均有明顯改善，其中100 μmol/L MT處理下牡丹幼苗植株干物質(zhì)量增幅最大，莖葉、根系和總干重相對(duì)于干旱脅迫處理分別顯著提高了67.59%、40.00%和64.75%，與對(duì)照相比，干物質(zhì)量指標(biāo)雖有一定降低，但差異并不顯著。50和200 μmol/L MT處理下牡丹幼苗植株干物質(zhì)量較干旱脅迫處理雖有顯著提高，但根系和總干重兩指標(biāo)均顯著低于100 μmol/L MT處理?？梢?，外源MT處理能有效緩解干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗生長的抑制，但外源MT的緩解作用存在濃度差異，以100 μmol/L MT處理效果最好。

2.2 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合作用的影響

2.2.1 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合色素含量的影響 如表1所示，干旱脅迫下牡丹幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b及類胡蘿卜素等光合色素含量較對(duì)照處理均有不同程度降低，各指標(biāo)降幅分別達(dá)42.68%、48.48%、44.39%和40.91%，且兩處理間不同指標(biāo)差異均顯著。經(jīng)不同濃度外源MT處理，除類胡蘿卜素含量指標(biāo)外，牡丹幼苗葉片光合色素含量較干旱脅迫處理均有顯著提高，其中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b及類胡蘿卜素等指標(biāo)增長范圍分別在5.56%-21.11%、8.82%-23.53%、6.45%-21.77% 和 7.69%-23.08%。不同濃度外源MT處理之間，以100 μmol/L MT處理下牡丹幼苗光合色素含量較干旱脅迫處理增幅最大，但仍顯著低于對(duì)照處理。100和200 μmol/L MT處理下牡丹幼苗光合色素含量均顯著高于50 μmol/L MT處理，而且200 μmol/L MT處理下各光合色素含量指標(biāo)雖略低于100 μmol/L MT處理，但兩處理間差異并不顯著。綜上所述，干旱脅迫導(dǎo)致牡丹幼苗葉片光合色素含量降低，而不同濃度外源MT處理有效提高了干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合色素含量，且100和200 μmol/L MT處理對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合色素含量的提高作用較好。

圖1 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗植株生長的影響

表1 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗光合色素含量的影響

2.2.2 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合參數(shù)的影響 如圖2所示，與對(duì)照相比，干旱脅迫下牡丹幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）及氣孔導(dǎo)度（Gs）分別顯著降低了58.08%、66.67%和75.01%，而胞間CO2濃度（Ci）則顯著提高了17.03%，說明干旱脅迫造成牡丹幼苗葉片光合作用過程受到抑制。經(jīng)不同濃度外源MT處理，不同程度改善了干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合參數(shù)指標(biāo)，具體表現(xiàn)為有效提高了凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）及氣孔導(dǎo)度（Gs）參數(shù)，而相對(duì)降低了干旱脅迫下牡丹幼苗葉片胞間CO2濃度（Ci）。其中，100 μmol/L MT處理下牡丹幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）及氣孔導(dǎo)度（Gs）較干旱脅迫處理增幅最為明顯，分別達(dá)117.08%、135.87%和180.01%，胞間CO2濃度（Ci）亦顯著降低了15.50%。繼續(xù)提高外源MT施用濃度，對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗光合作用的改善能力有所降低，表現(xiàn)為200 μmol/L MT處理下牡丹幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）及氣孔導(dǎo)度（Gs）雖顯著高于干旱脅迫處理，但此三項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)于100 μmol/L MT處理分別顯著降低了5.08%、17.97%和14.29%，而胞間CO2濃度（Ci）在兩處理間差異并不顯著。綜合來看，外源MT處理能夠有效緩解干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗葉片光合作用的抑制影響。在不同處理濃度上，以100 μmol/L MT處理改善葉片光合作用效果最為顯著，增加濃度會(huì)降低其緩解效果。

2.2.3 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片熒光參數(shù)的影響 如圖3所示，與對(duì)照相比，干旱脅迫下牡丹幼苗暗適應(yīng)葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)換效率（Fv'/Fm'）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、實(shí)際PSⅡ光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）及葉綠素?zé)晒夤饣瘜W(xué)猝滅系數(shù)（qP）均顯著降低，降幅分別達(dá)10.84%、28.38%、32.34%、63.33%和40.45%，而非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）則顯著提高了24.07%，說明干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗PSⅡ功能產(chǎn)生影響，其功能受到抑制。經(jīng)不同濃度外源MT處理后牡丹幼苗葉片光抑制程度有不同程度降低，具體表現(xiàn)為相對(duì)干旱脅迫處理暗適應(yīng)葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）提高了4.05%-9.46%、PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)換效率（Fv'/Fm'）提高了11.32%-30.19%、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）提高了13.27%-31.86%、實(shí)際PSⅡ光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）提高了54.55%-140.91%、葉綠素?zé)晒夤饣瘜W(xué)猝滅系數(shù)（qP）提高了28.30%-64.15%，而非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）的降低了4.48%-13.43%，且各處理間差異均顯著。在不同濃度外源MT處理之間，在緩解干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗葉片光抑制效果上表現(xiàn)出 100 μmol/L MT 處理 >200 μmol/L MT 處理>50 μmol/L MT處理的整體趨勢，說明外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光抑制的緩解效應(yīng)亦存在濃度差異，以100 μmol/L MT處理表現(xiàn)最好。

圖2 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片光合參數(shù)的影響

2.3 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片生理特性的影響

2.3.1 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片膜質(zhì)的影響 由圖4可知，干旱脅迫下牡丹幼苗葉片MDA含量、O2

-含量、H2O2含量及膜質(zhì)傷害指數(shù)較對(duì)照處理分別顯著提高了73.63%、63.64%、123.68%和168.75%，說明干旱脅迫處理下牡丹幼苗葉片細(xì)胞膜質(zhì)受到嚴(yán)重傷害。經(jīng)不同濃度外源MT處理，不同程度地緩解了干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗葉片細(xì)胞膜質(zhì)的影響，其中MDA含量顯著降低了17.88%-30.54%、O2-含量顯著降低了7.94%-23.02%、H2O2含量顯著降低了19.21%-38.41%、膜質(zhì)傷害指數(shù)顯著降低了15.73%-57.94%。不同濃度外源MT處理之間，以100 μmol/L MT處理下牡丹幼苗葉片膜質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)最低，尤其是H2O2含量和膜質(zhì)傷害指數(shù)均顯著低于50 μmol/L MT處理和200 μmol/L MT處理，說明外源MT能有效控制干旱脅迫對(duì)牡丹幼苗葉片細(xì)胞膜質(zhì)的破壞，且100 μmol/L MT處理效果優(yōu)于其他處理。

圖3 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片熒光參數(shù)的影響

2.3.2 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片抗氧化酶的影響 由圖5可知，與對(duì)照相比，干旱脅迫及不同外源MT處理下牡丹幼苗葉片不同抗氧化酶活性有不同變化。干旱脅迫處理下牡丹幼苗葉片超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶較對(duì)照處理有所升高，其中抗壞血酸過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶較對(duì)照處理分別顯著提高了15.40%和123.39%，而過氧化氫酶較對(duì)照處理則顯著降低了82.88%。經(jīng)不同濃度外源MT處理，牡丹幼苗葉片超氧化物歧化酶及谷胱甘肽還原酶較干旱脅迫處理有不同程度降低，其中以100 μmol/L MT處理降幅最大，分別顯著降低了74.93%和49.75%；而過氧化氫酶及抗壞血酸過氧化物酶則有所提高，其中50 μmol/L MT處理較干旱脅迫處理分別顯著提高了118.47%和16.17%、100 μmol/L MT處理較干旱脅迫處理分別顯著提高了230.30%和86.76%、200 μmol/L MT處理較干旱脅迫處理分別顯著提高了237.26%和42.12%。

綜上所述，牡丹幼苗葉片不同抗氧化酶對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)不盡相同，同時(shí)外源MT處理能夠介導(dǎo)調(diào)節(jié)牡丹幼苗葉片抗氧化酶活性，以抵御干旱脅迫造成的過氧化傷害對(duì)葉片的傷害。

2.3.3 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)的影響 由圖6可知，與對(duì)照相比，干旱脅迫處理下牡丹幼苗葉片可溶性糖蛋白含量顯著降低了24.54%，而可溶性糖及脯氨酸含量分別顯著提高了36.67%和30.82%，說明干旱脅迫影響到牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)平衡。與干旱脅迫處理相比，不同濃度外源MT處理下牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均有所提高，在可溶性蛋白和脯氨酸含量上表現(xiàn)為 100 μmol/L MT 處理 >200 μmol/L MT 處理>50 μmol/L MT處理的趨勢，且各處理間差異均顯著。100 μmol/L MT處理下牡丹幼苗葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量最高，較干旱脅迫處理分別顯著提高了48.78%和87.79%。而在可溶性糖含量方面，呈現(xiàn)出隨著外源MT處理濃度增加而增加的趨勢，其中200 μmol/L MT處理較干旱脅迫處理顯著提高了134.15%。從以上分析可知，外源MT處理能有效促進(jìn)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，并以此應(yīng)對(duì)干旱脅迫對(duì)葉片細(xì)胞造成的滲透脅迫傷害。

圖4 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片膜質(zhì)的影響

3 討論

干旱脅迫下植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)產(chǎn)生異常，致使細(xì)胞生長和增殖受到抑制，最終影響植物生長和干物質(zhì)量積累［31］。本研究中，干旱脅迫嚴(yán)重限制了牡丹幼苗根系和地上部干無質(zhì)量的積累，經(jīng)外源褪黑素處理后牡丹幼苗干物質(zhì)量有不同程度提高，其中以100 μmol/L MT處理下增幅最大。本研究表明，外源褪黑素處理能有效促進(jìn)干旱脅迫下牡丹幼苗生長，這與在大豆［13］、蘋果［32］等作物上得到的結(jié)論一致。據(jù)報(bào)道，褪黑素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞壁延伸的物理過程以誘導(dǎo)植物根系生長，在干旱環(huán)境中相對(duì)旺盛生長的根系吸水能力提高并促進(jìn)了地上部莖葉的生長［33］。同時(shí)，經(jīng)褪黑素預(yù)處理有效緩解了干旱脅迫引起的植物光合作用抑制現(xiàn)象，促進(jìn)植物生長以及提高其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性［34］，這在本試驗(yàn)中對(duì)牡丹幼苗光合及熒光特性的研究中也得到了驗(yàn)證。

圖5 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片抗氧化酶的影響

植物葉片光合色素含量及光合熒光特性是表征植物光合作用進(jìn)程的重要參數(shù)。在干旱脅迫條件下，植物葉片葉綠素合成緩慢或者被快速分解，從而導(dǎo)致葉綠素含量減少，直接影響到植物的正常生長發(fā)育［35］。研究表明，應(yīng)用外源褪黑素處理可能抑制干旱脅迫造成的葉綠素降解酶活性的增強(qiáng)，或者促進(jìn)參與葉綠素生物合成的δ氨基乙酰丙酸和原葉綠素酸酯還原酶復(fù)合體的合成，從而提高了植物葉片葉綠素含量［36］。值得注意的是，本研究中外源褪黑素處理除顯著提高了牡丹幼苗葉片葉綠素a及葉綠素b含量以外，對(duì)提升葉片類胡蘿卜素含量亦有顯著作用。類胡蘿卜素在光合作用中可作為抗氧化劑參與到光保護(hù)過程，能夠防止脂質(zhì)過氧化以及穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［37］。本研究中，100和200 μmol/L MT處理下牡丹幼苗葉片類胡蘿卜素含量顯著提高，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和完整性有重要意義。

光合作用是植物進(jìn)行有機(jī)物合成的主要途徑，本研究中干旱脅迫下牡丹幼苗葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）降低，而胞間CO2濃度（Ci）升高，說明干旱脅迫導(dǎo)致牡丹幼苗葉片光合作用生理過程紊亂。外源褪黑素處理能有效改善牡丹幼苗葉片光合作用參數(shù)，可能是因?yàn)榻?jīng)預(yù)處理后葉片光合色素含量增加，同時(shí)植株根系旺盛生長的同時(shí)促進(jìn)了地上部莖葉的生長，光合作用性能得到改善［38］。干旱脅迫下，植物葉片光合保護(hù)機(jī)構(gòu)受損，PSⅡ功能受到抑制其實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率大大降低［4，7-8］。本研究中，經(jīng)外源褪黑素處理干旱脅迫下牡丹幼苗暗適應(yīng)葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)換效率（Fv'/Fm'）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、實(shí)際PSⅡ光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）及葉綠素?zé)晒夤饣瘜W(xué)猝滅系數(shù)（qP）均顯著提高，而非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）則顯著降低，說明褪黑素處理有助于維持較高的熒光電子傳遞效率及緩解PSⅡ反應(yīng)中心被破壞程度，這與前人的研究結(jié)果一致［39］。有報(bào)道指出，褪黑素可作為抗氧化劑介入植物對(duì)干旱脅迫引起的過氧化防御體系，保護(hù)光合作用中的電子傳遞體免受傷害，從而減少對(duì)光合電子傳遞速率的影響［40］。

干旱脅迫下植物生成過量活性氧自由基，損傷細(xì)胞質(zhì)膜并破壞正常的生理生化代謝，同時(shí)植物通過抗氧化酶防御系統(tǒng)等機(jī)制應(yīng)對(duì)過氧化脅迫［41］。丙二醛是表征細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，而細(xì)胞膜損害指數(shù)與干旱造成的脅迫效應(yīng)呈正比，H2O2和O2-含量亦是常用來判斷細(xì)胞過氧化程度的重要指標(biāo)［42］。本研究中，干旱脅迫導(dǎo)致牡丹幼苗葉片MDA、H2O2、O2-含量及細(xì)胞膜損害指數(shù)大幅提高，說明脅迫下ROS過量產(chǎn)生，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性。經(jīng)外源褪黑素處理，MDA、H2O2、O2-含量及細(xì)胞膜損害指數(shù)均有不同程度降低，尤其是100 μmol/L MT處理中各項(xiàng)指標(biāo)最低，表明褪黑素可以作為抗氧化劑，遏制干旱脅迫導(dǎo)致的過量自由基積累，從而大大減少ROS等物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性作用［43］。本研究中，外源MT處理能夠介導(dǎo)調(diào)節(jié)牡丹幼苗葉片抗氧化酶活性，以此參與提高牡丹幼苗的抗旱性。有研究表明，MDA含量的增加可能與CAT和APX酶活性降低有關(guān)，導(dǎo)致OH·無法得到有效清除，并導(dǎo)致H2O2和O2-過量產(chǎn)生［44］。因此，經(jīng)外源褪黑素處理牡丹幼苗葉片H2O2和O2-含量降低可能與SOD、CAT和APX等抗氧化酶相互協(xié)調(diào)介導(dǎo)有很大關(guān)系，這也在試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。

滲透調(diào)節(jié)是植物為了應(yīng)對(duì)水分脅迫而進(jìn)化的生理機(jī)制之一，逆境條件下植物細(xì)胞積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以降低植物葉片細(xì)胞水勢，促進(jìn)植物對(duì)水分的吸收以減輕脅迫傷害［41］。本研究中，經(jīng)外源褪黑素處理，特別是100 μmol/L MT處理中牡丹幼苗葉片脯氨酸及可溶性蛋白含量提高最多，緩解了低滲透壓對(duì)細(xì)胞的毒害作用。而在可溶性糖含量，所有經(jīng)外源褪黑素處理均高于對(duì)照和干旱脅迫處理，尤其以200 μmol/L MT處理中可溶性糖含量最高。有研究指出，可溶性糖可能通過氫鍵與蛋白質(zhì)在質(zhì)膜相互作用，從而防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性作用［45］。本研究中，干旱脅迫下牡丹幼苗葉片可溶性蛋白水解加快導(dǎo)致其含量顯著降低，而經(jīng)外源褪黑素處理后葉片可溶性蛋白含量顯著提高，說明褪黑素可能抑制干旱脅迫下牡丹幼苗葉片可溶性蛋白降解或者促進(jìn)新的可溶性蛋白合成。此外，本研究中經(jīng)外源褪黑素處理葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高表明，經(jīng)外源褪黑素處理的牡丹幼苗具有較高的滲透調(diào)節(jié)能力，緩解干旱脅迫造成的傷害。

圖6 外源MT對(duì)干旱脅迫下牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

4 結(jié)論

干旱脅迫嚴(yán)重抑制了牡丹幼苗的生長，施用外源褪黑素能有效提高其在干旱脅迫中的適應(yīng)性，且以100 μmol/L褪黑素處理效果最好。干旱脅迫下，經(jīng)褪黑素預(yù)處理可以提高抗氧化酶活性以降低脂質(zhì)過氧化對(duì)細(xì)胞膜的損傷，抑制蛋白質(zhì)降解或誘導(dǎo)其和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，同時(shí)保持較高的光合色素含量及改善光合熒光特性，最終表現(xiàn)為促進(jìn)干旱脅迫下牡丹幼苗生長。