王建波 張晨新 馬永鋼 蔡昀潞 李秀靈 王洪薇 曲 怡

（遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術中心，遼寧沈陽110847）

高血壓作為心血管疾病發(fā)病及死亡的危險因素之一，其臨床的發(fā)生率逐年升高，是常伴有心、腦、腎及主動脈等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征[1]。根據(jù)《中國高血壓防治指南（2018 年修訂版）》[2]，中國人群高血壓的危險因素主要包括高鈉低鉀膳食、超重和肥胖、過量飲酒、精神緊張和缺乏體力活動等。近年來，我國肥胖型高血壓的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[3]。肥胖型高血壓伴隨的糖脂代謝紊亂會加重血管內皮的炎癥反應，進一步加重靶器官的損傷。美國心臟協(xié)會、美國心臟病學會、肥胖學會《成人超重和肥胖管理指南》已經(jīng)明確了減重的降壓作用[4]：（1）體重減少3%～5%即可明顯改善糖脂代謝；（2）體重下降5%可使收縮壓和舒張壓分別下降3和2 mmHg。因此，對肥胖型高血壓患者體重的控制尤為重要。目前國內針對肥胖型高血壓藥物治療常選用降壓藥聯(lián)合減肥藥物（奧利司他或具有減重作用的降糖藥物等），而難治類肥胖型高血壓并無有效控制手段，常輔助以代謝手術治療，造成很大的身體創(chuàng)傷，所以有效的肥胖型高血壓控制手段值得我們進行深入研究。

現(xiàn)有研究表明，防己黃芪湯可以抑制進食進水欲望，改善內臟體脂分布，調節(jié)瘦素、脂聯(lián)素水平，縮小脂肪細胞體積，改善炎癥反應等，有減輕體重、降低血壓等功效[5]。本研究旨在明確防己黃芪湯對肥胖型高血壓大鼠血管內皮的保護作用，為難治性肥胖型高血壓臨床治療提供新思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）60只，Wistar-kyoto（WKY）大鼠10只，體質量（200±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心，濕度為（45±5）%，溫度為（22±1）℃。實驗過程中對實驗動物的處置符合國家科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定，本實驗通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心倫理委員會審議同意并簽署批準意見。

1.2 主要儀器 智能無創(chuàng)血壓計（BP-2010A日本）；熒光定量PCR儀（Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm）；SpectraMax i3多 功 能 酶 標 儀（奧 地 利，Molecu-lar Devices）；ABI Veriti梯 度PCR儀器（Applied Biosystems）；超微量紫外分光光度計（Thermo，NANO-DROP 2000）；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；VE-386 半干轉移電泳槽、EPS-600 電泳儀、VE-180 垂直電泳槽（Tanon Science＆Technology Co.，Ltd，天能）。

1.3 藥物與試劑 防己黃芪湯藥物組成：防己12 g，黃芪15 g，白術9 g，甘草6 g，生姜10 g，大棗5 g。上述是成年人1日劑量，共57 g。根據(jù)體表面積法換算大鼠給藥量，算出低、中、高劑量藥物濃度分別 為3.125 g/kg、6.25 g/kg、9.375 g/kg。將 購 買 的藥物顆粒（遼寧省中醫(yī)院中藥局制）放入100 ℃蒸餾水中加熱溶解，分裝置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。奧利司他膠囊（重慶植恩藥物有限公司，批號20180604 W0039），成人每日用量為120 mg，按照人與大鼠給藥量換算，大鼠給藥量為1.23 g/kg。常溫蒸餾水溶解奧利司他，分裝置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

LEP Elisa試劑盒（北京誠林，批號201911）；ADP Elisa試 劑 盒（北 京 誠 林，批 號201911）；PCR反轉試劑盒（康為世紀，批號40326）；PCR擴增試劑盒（康為世紀，批號60407）；Trizol總RNA抽 提 試 劑（碧 云 天，批 號R0061）；PCR引物（博邁德引物合成公司）；組織/細胞裂解液（索萊寶，批號20190418）；蛋白酶抑制劑（索萊寶，批號0190505）；蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，批號P0012S）；蛋白上樣緩沖液（凱基生物，批號051319190513）；發(fā)光液（碧云天，批號P0018S）；凝膠快速配置試劑盒（碧云天，批號P0012AC）；蛋白標記物（凱基生物，批號20171113）；內參一 抗（愛 必 信，批 號5814）；PPAR-γ一抗（圣克魯斯生物技術公司，批號00073972），二抗（安諾倫生物科技有限公司，批號RS0001）；PVDF膜（邁博瑞生物膜技術有限公司，批號R9EA30212）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 取WKY大鼠10只為空白組。取雄性SHR 60只，按隨機數(shù)字表法分為模型組、肥胖模型組、西藥組和防己黃芪湯低、中、高劑量組，每組10只。所有大鼠于SPF級動物實驗中心適應性飼養(yǎng)1周，均予普通飼料，監(jiān)測SHR收縮壓均大于150 mmHg。隨后進入實驗階段，空白組、模型組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其余各組采用高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料由基礎飼料加入動物油15%、蔗糖18%、蛋黃3%，經(jīng)過滅菌后，陰涼處保存。造模期間，每周定時檢測2次血壓、體重與進食量并記錄。當除空白組、模型組外的其余各組大鼠體重超過空白組體重的20%[6]，血壓為160～179/100～109 mmHg，提示肥胖型高血壓大鼠模型復制成功。實驗期間飲水飲食自由。

2.2 藥物干預 空白組整個實驗期間正常飼養(yǎng)，不做任何處理。防己黃芪湯各劑量組大鼠分別予中藥顆粒劑溶液3.125 g/kg、6.25 g/kg、9.375 g/kg藥量灌胃，西藥組大鼠予1.23g/kg奧利司他溶液灌胃，模型組與肥胖模型組給予等量蒸餾水灌胃，各組均每日灌胃1次，連續(xù)4周。

2.3 取材 灌胃4 周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，稱量體質量后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg體質量），麻醉后用高壓滅菌后的手術剪打開腹腔，干凈紗布撥開臟器，找到腹主動脈，取血后剔除血管粘連漿膜，用玻璃分針游離出胸主動脈組織，修剪末支后置于凍存管中放入液氮保存。

2.4 觀察指標

2.4.1 RT-PCR檢 測核 轉錄因子（NF-κB）、內皮素-1（ET-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達 每個凍存管中取大鼠主動脈100 mg，剪碎，取適量液氮研磨后，加入1 mL Trizol試劑勻漿提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，然后進行cDNA反轉錄，最后對反轉錄產(chǎn)物進行擴增，反應體系為20 μL，反 應 條 件 為stage1（95 ℃，30 s）、stage2（95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40個循環(huán)）。溶解反應按ABI 7500自動設定的條件進行，即：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s。PCR所需特異性引物序列見表1。

表1 PCR 擴增的特異性引物序列

2.4.2 Elisa法檢測主動脈瘦素、脂聯(lián)素濃度 取各組主動脈組織100 mg分裝各管，每管中加入一定量PBS（pH7.4）制成勻漿液，離心半徑為20 cm，3000 r/min離心15 min后，仔細收取上清。設置空白孔、標準品孔和待測樣本孔。在標準品孔加不同量的標準品及標準品稀釋液共50 μL，在樣本孔中加入待測樣本50 μL；加入酶標試劑50 μL，封板膜后37 ℃溫育30 min；洗滌4～5 次，加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，封板膜后37 ℃溫育30 min；最后加入終止液50 μL，450 nm波長測定各孔的吸光度。用標準品孔的OD值繪制y=ax+b曲線，將各組的數(shù)值代入可計算出主動脈中瘦素、脂聯(lián)素濃度。

2.4.3 Western Blot檢測各組大鼠主動脈組織過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR-γ）蛋白表達 取主動脈組織100 mg分裝各管，每管加入1 mL RIPA裂解液，研磨、離心后提取上清為總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定主動脈總的蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白。灌制SDS-聚丙稀酰胺凝膠進行電泳，分離膠電泳采用80 V電壓，120 V電壓進行濃縮膠電泳。電泳結束后取出凝膠，將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上，經(jīng)封閉液37 ℃封閉1 h后，4 ℃孵育一抗，過夜，TBST清洗后37 ℃孵育二抗1 h，TBST清洗后用ECL試劑盒檢測，使用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)成像，采用photoshop分析軟件檢測條帶灰度值，得出PPAR-γ/β-actin的灰度值比值，為PPAR-γ的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均用（±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較。組間方差齊時，采用LSD檢驗；方差不齊時，采用Tamhane’s T2（M）檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠主動脈組織NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA

表達比較 結果見表2。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動脈組織NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA表達均明顯上調（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠上述指標表達明顯上調（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各給藥組大鼠上述指標表達明顯下調（P<0.05），其中防己黃芪湯高劑量組和西藥組下調最為明顯。

3.2 各組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達比較 結果見表3。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達明顯下調（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達明下調（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各給藥組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達明顯上調（P<0.05），其中高劑量組和西藥組上調最為明顯。

表2 各組大鼠胸主動脈NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA 表達比較（±s）

表2 各組大鼠胸主動脈NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA 表達比較（±s）

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動物數(shù)/只 NF-κB ET-1 ICAM-1空白組 10 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 10 10.40±2.59# 15.10±1.91# 7.79±2.44#肥胖模型組 10 29.15±5.62#* 26.90±1.79#* 32.01±2.05#*防己黃芪湯低劑量組 10 18.84±2.22#*△● 15.54±0.65#△● 29.20±2.31#*●防己黃芪湯中劑量組 10 8.49±3.36#△ 7.45±0.28#*△ 13.00±2.57#*△●防己黃芪湯高劑量組 10 1.14±0.53*△▲ 4.29±1.55#*△ 1.42±0.49*△▲西藥組 10 0.81±0.18*△▲ 5.18±1.45#*△ 1.31±0.09*△▲

表3 各組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達比較（±s） 單位：μg/L

表3 各組大鼠主動脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達比較（±s） 單位：μg/L

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動物數(shù)/只 瘦素 脂聯(lián)素空白組 10 19.58±0.91 152.98±5.05模型組 10 14.45±0.26# 70.93±4.26#肥胖模型組 10 10.70±0.35#* 56.68±5.50#*防己黃芪湯低劑量組 10 15.63±0.50#△● 71.21±7.74#△●防己黃芪湯中劑量組 10 18.17±0.63#*△ 117.31±14.71#*△●防己黃芪湯高劑量組 10 19.27±0.71*△ 143.15±9.57*△▲西藥組 10 20.14±1.21*△▲ 150.18±2.93*△▲

3.3 各組大鼠主動脈組織PPAR-γ表達比較 見表4、圖1。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動脈組織PPAR-γ蛋白表達明顯下調（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠主動脈組織PPAR-γ蛋白表達明顯下調（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各治療組大鼠主動脈組織PPAR-γ蛋白表達明顯上調（P<0.05），其中高劑量組和西藥組上調最為明顯。

表4 各組大鼠主動脈組織PPAR-γ 灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠主動脈組織PPAR-γ 灰度值比較（±s）

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動物數(shù)/只 PPAR-γ空白組 10 1.45±0.24模型組 10 0.77±0.10#肥胖模型組 10 0.48±0.06#*防己黃芪湯低劑量組 10 0.97±0.17#△●防己黃芪湯中劑量組 10 0.93±0.10#△防己黃芪湯高劑量組 10 1.17±0.08#*△▲西藥組 10 1.14±0.09*△

圖1 各組大鼠胸主動脈PPAR-γ 表達比較

4 討論

《中國成年人超重和肥胖與高血壓發(fā)病關系的隨訪研究》[7]發(fā)現(xiàn)，肥胖組高血壓發(fā)病率是正常組的1.16～1.28倍。肥胖病機多為痰瘀與陰虛。隨著經(jīng)濟水平的提高與人們生活方式的改變，肥胖型高血壓的主要誘因是飲食不節(jié)而致過氧化物增多，脂質代謝紊亂，氣血津液運行不暢，津液停聚為痰，血行不暢留為瘀，痰瘀互結，損傷絡脈，中醫(yī)辨證為痰濕壅盛證，正如《醫(yī)學正傳》[8]說“津液黏稠，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁”。痰濁等病理產(chǎn)物隨著經(jīng)脈上犯清竅，以致血壓升高、眩暈頭痛。中醫(yī)證候學中指出脂質代謝紊亂與痰濁血瘀關系最為密切[9]。防己黃芪湯出自張仲景《金匱要略》，主治表虛不固之風水、風濕。防己苦泄辛散、祛風除濕，黃芪補氣健脾、固表行水，白術、甘草健脾益氣，白術、防己滲濕利水。諸藥合用，共奏益氣化痰、利水除濕之效?，F(xiàn)代學者多用于肥胖型高血壓的治療，具有減重與降壓的雙重功效[10-12]。

PPAR-γ屬于非甾體核受體超家族，主要在肝臟、脂肪組織、血管平滑肌細胞、內皮細胞中表達，其與許多病理生理過程如肥胖、胰島素抵抗、高血壓、糖尿病和腫瘤等威脅人體健康的疾病相關。血管內皮中PPAR-γ表達升高可以抑制血管重構[13]，多個參與脂肪前體細胞分化的基因的轉錄由PPAR-γ調控，且PPAR-γ可以調節(jié)胰島素介導的外周組織對葡萄糖的攝取。由此可見，PPAR-γ與脂質儲存和血管病變密切相關。PPAR-γ的生物學功能主要為改善糖脂代謝異常，通過改善胰島素抵抗，糾正脂質代謝紊亂，抑制平滑肌細胞和內皮細胞的增殖與遷移，從而改善血管病理性重構，具有降壓減重的雙重功效。PPAR-γ可被多種脂肪酸及其衍生物激活，在糖脂代謝中起著重要的調節(jié)作用。PPAR-γ參與炎癥的形成[14]。在炎性反應中，PPAR-γ通過抑制NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/激活蛋白1（AP-1）、環(huán)氧合酶（COX）等多途徑，降低ICAM-1、ET-1、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等因子產(chǎn)生、釋放及表達[15-16]。

調節(jié)胰島素敏感性方面，PPAR-γ的激活會使巨噬細胞產(chǎn)生M2抗炎因子，減少白介素（IL）-1β、IL-6、TNF-α的分泌量和胰島素抵抗，同時上調脂聯(lián)素與瘦素表達，實現(xiàn)降低胰島素抵抗的效果。既往研究證實，中藥復方中有許多活性成分與單體能夠上調或激活組織內PPAR-γ基因的表達，從而抑制炎癥反應[17]。現(xiàn)推測防己黃芪湯可能通過調控PPAR-γ抑制NF-κB表達抑制主動脈炎癥反應，通過上調瘦素、脂聯(lián)素的表達調節(jié)胰島素敏感性。

本研究結果表明，模型組大鼠NF-κB、ICAM-1、ET-1 mRNA升高，PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素降低，肥胖模型組大鼠比模型組更甚。防己黃芪湯各劑量可以顯著下調NF-κB、ICAM-1、ET-1 mRNA表達，上調PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素的表達，表明防己黃芪湯可以抑制NF-κB信號通路的激活和炎癥因子的表達，調整PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素的失衡狀態(tài)，調節(jié)胰島素敏感性，降低血壓，保護主動脈組織的損傷，延緩高血壓對靶器官的損傷。

本研究下一步預計進行細胞實驗，在細胞水平明確防己黃芪湯對脂肪細胞內糖脂代謝相關信號通路作用機制。通過檢測細胞增殖，檢測PPAR-γ-LXR-ABCA1信號通路對ABCA-1和LRP-1作用下的胞內外膽固醇交換作用以及防己黃芪湯對脂肪細胞自噬的影響，驗證防己黃芪湯對脂肪前體細胞分化的干預作用，從而明確防己黃芪湯對關鍵性靶點分子PPAR-γ及其相關糖脂代謝信號通路調控作用，以精準地用醫(yī)學理論闡釋防己黃芪湯對心腎微血管功能損傷的作用靶點以及調節(jié)機制，為探索肥胖型高血壓中藥干預策略，推動高血壓預防、評價和治療體系建設奠定基礎。