張國臣 常玉喜 韓 磊 徐 欣 趙 明 陳忠平

O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）可以修復(fù)烷化劑對染色體的致癌、致突變和細(xì)胞毒作用的損傷。在正常情況下，MGMT對細(xì)胞起保護(hù)作用，但是在膠質(zhì)瘤的化療過程中，MGMT 可以修復(fù)化療藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷，從而降低化療療效[1]。MGMT 基因啟動子甲基化（簡稱MGMT 甲基化）可以降低MGMT的表達(dá)。本文定量分析新診斷膠質(zhì)瘤MGMT甲基化水平，為臨床診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科2016年1月至2019年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為膠質(zhì)瘤標(biāo)本225例，其中男116例，女109例；平均年齡（48.71±14.82）歲；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤50 例（WHO分級Ⅱ級36 例，Ⅲ級14 例），星形細(xì)胞瘤109 例（WHO分級Ⅰ級4例，Ⅱ級58例，Ⅲ級47例），少突星形細(xì)胞瘤9 例（WHO 分級Ⅱ級），膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHO分級Ⅳ級）57例。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤；新診斷初治膠質(zhì)瘤；腫瘤組織行MGMT甲基化水平檢測。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后病理證實(shí)為非膠質(zhì)瘤；既往經(jīng)過放、化療等治療的復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤；腫瘤組織未行MGMT甲基化水平檢測。

1.4 MGMT 的檢測 采用焦磷酸測序儀（美國QIAGEN 公司，Qiagen PyroMark Q24），嚴(yán)格按照Human MGMT Gene methylation Detection Kit 試劑盒（美國QIAGEN公司）說明書進(jìn)行測序。采用TIANamp FFPE DNA Kit 提取DNA，DNA 濃度為20 ng/μl，OD 260/280 為1.82，檢測靈敏度為1%（10 ng/μl DNA），引物類型為YGAYGTTYGTAGGTTTTYGT。標(biāo)本類型為石蠟塊。結(jié)果判讀：選擇MGMT 基因啟動子區(qū)甲基化水平最高的4 個CpG 位點(diǎn)，將各位點(diǎn)的甲基化水平以百分率的形式作為定量數(shù)據(jù)，取4 個位點(diǎn)的平均值作為最終MGMT甲基化水平。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn) 健康人群血液平均檢測值：MGMT 甲基化水平≤4%。膠質(zhì)瘤平均檢測值：MGMT 甲基化水平≥8%為陽性，否則判為陰性，其中MGMT甲基化水平≥40%病人，替莫唑胺化療總生存期明顯延長[2]。1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 19.0軟件處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)系數(shù)或Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

新診斷膠質(zhì)瘤MGMT基因啟動子甲基化水平為（23.68±14.88）%，陽性率為89.33%?！?0 歲病人MGMT 甲基化水平明顯高于＜40 歲病人（P＜0.05，表1），少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤MGMT 甲基化水平較星形細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤均明顯增高（P＜0.05，表1）。而不同性別、不同WHO 分級病人MGMT甲基化水平均無明顯差異（P＞0.05，表1）。膠質(zhì)瘤MGMT 甲基化水平與病人年齡呈正相關(guān)（r=0.135，P＜0.05），而與病人性別和腫瘤WHO 級別無明顯關(guān)系（P＞0.05）。

3 討論

MGMT既能修復(fù)外界不良因素對正常細(xì)胞造成的損害，也可修復(fù)化療藥物對腫瘤細(xì)胞造成的殺傷。影響MGMT 表達(dá)的因素很多。Ovchinnikov 等[3]證實(shí)，MGMT基因啟動子CpG島處于甲基化狀態(tài)，可導(dǎo)致MGMT 基因停止轉(zhuǎn)錄，從而減少M(fèi)GMT 的表達(dá)。另外，趙宇航等[4]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT 甲基化、IDH1 突變、P53 和TERT 突變之間存在復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)作用。目前認(rèn)為，MGMT 甲基化是膠質(zhì)瘤病人預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測因素之一[5]，檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT甲基化可以預(yù)測烷化劑等化療藥物的效果[6]。

對于MGMT 甲基化檢測方法，起初多采用免疫組織化學(xué)法，并將其分為陰性（-）、弱陽性或可疑陽性（+/-）、陽性（+）、中等陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++），間接說明MGMT甲基化程度[7]，并用于指導(dǎo)膠質(zhì)瘤化療方案的選擇[8]；但是該方法為MGMT 的定性分析，結(jié)果受主觀因素影響較大，且表達(dá)量的多少容易受到電離輻射、糖皮質(zhì)激素等的影響，并不能精確地指導(dǎo)化療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Pulling等[9]利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測MGMT 甲基化水平，并與既往免疫組織化學(xué)法結(jié)果相比較，兩者符合率達(dá)83%，但沒有研究MGMT 甲基化的程度。對于MGMT甲基化陽性病例，因MGMT活性有強(qiáng)弱之分，對化療藥物的殺傷修復(fù)能力也一定有差別，化療藥物效果也勢必不同，因此，單純定性分析MGMT甲基化，并不能很好地指導(dǎo)化療。

表1 新診斷膠質(zhì)瘤MGMT基因啟動子甲基化水平量化分析結(jié)果

我們采用焦磷酸測序檢測方法，選擇MGMT 基因啟動子甲基化水平最高的四個CpG 位點(diǎn)，將甲基化水平以百分率的形式表示，取四個位點(diǎn)的平均值進(jìn)行量化分析MGMT 甲基化水平。按照本文標(biāo)準(zhǔn)，本文病人MGMT 甲基化陽性率為89.33%，且不受性別、年齡、腫瘤類型、腫瘤級別的影響，與文獻(xiàn)[10]報道基本相符。雖然MGMT 甲基化陽性率較高，但是膠質(zhì)瘤病人預(yù)后并不好，本文發(fā)現(xiàn)MGMT 甲基化水平≥40%的病人僅占11.11%，可能調(diào)高M(jìn)GMT 甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)更符合臨床實(shí)際。黃磊等[11]報道，MGMT水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，且男性MGMT mRNA 含量較女性高。本文MGMT 甲基化水平與病人年齡正相關(guān)，年齡越大MGMT甲基化水平越高（P＜0.05），但是不同性別之間并無明顯差異（P＞0.05），與上述文獻(xiàn)不全相符。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，不同病理類型膠質(zhì)瘤MGMT 甲基化水平也有差異，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤MGMT 甲基化水平明顯高于星形細(xì)胞瘤（P＜0.05），與文獻(xiàn)[12]報道相符，這可能也是少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤病人放、化療效果較好的原因之一。唐天友等[13]認(rèn)為，MGMT 甲基化水平越高，膠質(zhì)瘤級別越高。陳功等[14]認(rèn)為高級別膠質(zhì)瘤MGMT甲基化水平低于低級別膠質(zhì)瘤，并認(rèn)為其是高級別膠質(zhì)瘤預(yù)后較差的因素之一。本文結(jié)果顯示，MGMT 甲基化水平與膠質(zhì)瘤級別均無明顯關(guān)系（P＞0.05），與文獻(xiàn)報道不同，實(shí)際情況有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。總之，新診斷膠質(zhì)瘤MGMT 甲基化水平與病人與年齡正相關(guān)，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤MGMT 甲基化水平明顯高于其他類型膠質(zhì)瘤。